日本血吸蟲22.6kD重組抗原二步金標(biāo)免疫滲濾法診斷家畜血吸蟲病的初步研究

付 媛，何永強(qiáng)，盧福莊，顧 昀，石團(tuán)員，馮尚連，張雪娟

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，浙江 杭州 310021;2.浙江出入境檢驗(yàn)檢疫局 技術(shù)中心，浙江 杭州 310012)

日本血吸蟲病是一種由日本血吸蟲寄生引起肝臟、腸道以及其他器官損傷的人畜共患病。日本血吸蟲病的血清學(xué)檢測方法，還存在著操作繁復(fù)，需要特殊儀器和設(shè)備不足等條件的限制，并且抗原的獲得需要血吸蟲人工感染兔，制備周期長，所以本研究利用基因工程技術(shù)克隆表達(dá)重組抗原，建立了重組抗原膠體金免疫滲濾法(RAg-T-DIGFA)，快速簡便適用于家畜血吸蟲病的現(xiàn)場診斷。

1 材料與方法

1.1 材料

待檢血紙血清制備保存。湖北、四川、浙江等省經(jīng)糞孵法檢測日本血吸蟲陽性牛血紙25份，陰性牛血紙68份。人工感染日本血吸蟲牛，兔，感染前后分別采血，制備血紙。采集血紙，待檢血液將濾紙浸透，晾干，4℃保存?zhèn)溆谩z測時(shí)用打孔器裁取待檢干燥血紙圓片(0.24 cm2)，由250 μL生理鹽水浸透30 min后備用。待檢血清包括血吸蟲感染豬血清4份，豬蛔蟲病血清2份，豬囊蟲病血清4份，豬旋毛蟲病血清2份，豬弓形蟲病血清3份，血吸蟲人工感染牛血清45份，血吸蟲人工感染兔血清15份，健康豬、兔、牛、羊血清5份，牛羊肝片吸蟲血清4份由本室保存，檢測時(shí)用生理鹽水1∶40倍稀釋后備用。

膠體金溶液的制備。膠體金溶液制備參照Slot［1］檸檬酸鈉-鞣酸還原法稍作改進(jìn)，制成的膠體金顆粒直徑為10～12 nm。

重組蛋白的制備。按照本研究室報(bào)道的方法［2］進(jìn)行，已構(gòu)建好的表達(dá)質(zhì)粒 pGEX-kg-sj22.6在大腸桿菌中表達(dá)，用谷胱甘肽瓊脂糖凝膠親和層析純化的重組蛋白，用SDS-PAGE和Western blot方法檢測其免疫原性，并通過Dnastar軟件包分析其序列信息，用紫外分光光度計(jì)測量其濃度。

重組抗原與金溶膠的交聯(lián)。膠體金溶液用0.25 mol·L－1K2CO3將 pH調(diào)至重組蛋白的等電點(diǎn)偏堿性，根據(jù)文獻(xiàn)［3］中的方法用10%NaCl確定待標(biāo)記蛋白最適用量，100mL膠體金中加入血吸蟲重組抗原GST-Sj22.6抗原320 μL包被膠體金，加入終濃度為適量的BSA和0.05%防腐劑疊氮鈉，分光光度計(jì)測量其525 nm處D值為1.8～2.0之間，置4～8℃保存?zhèn)溆谩?/p>

反應(yīng)盒。由3部分組成:小盒為4 cm×3 cm×0.6 cm的塑料扁盒，分盒底與盒蓋2部分，蓋上有5個(gè)直徑為0.5 cm的橢圓孔;吸水墊料，市售;硝酸纖維素膜，為浙江臺州四甲生化材料廠產(chǎn)品，孔徑為 0.45 μm。

T-DIGFA診斷試劑盒。由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所提供。該試劑盒由反應(yīng)盒、金標(biāo)診斷試劑、洗滌液組成。

1.2 方法

RAg-T-DIGFA反應(yīng)程序。具體方法參考盧福莊等［2］建立的方法進(jìn)行，用內(nèi)徑1 mm玻璃毛細(xì)管吸取待檢血紙浸出液，將血紙浸出液樣品依次點(diǎn)在塑料反應(yīng)盒中央孔的硝酸纖維素膜上，每個(gè)反應(yīng)盒可以點(diǎn)10份樣品，結(jié)合3 min后滴加洗滌液pH 6.24 PBS 50 μL待滲入后加膠體金探針50 μL，最后加洗滌液50 μL，以洗去未結(jié)合的金標(biāo)記結(jié)合物。如在膜上顯現(xiàn)紅色斑點(diǎn)為陽性，粉色或者淡黃色為陰性。

敏感性和特異性試驗(yàn)。感染血吸蟲尾蚴50～500條的牛4頭，人工感染血吸蟲尾蚴50～500條的兔5只，在感染后0、7、14、21、28、35、42 d(兔為41 d)時(shí)分別采血制備血紙。經(jīng)解剖沖蟲法確診感染1對血吸蟲的牛血紙。檢驗(yàn)RAg-T-DIGFA法的敏感性。以T-DIGFA法檢測健康牛、兔血清共25份、人工感染血吸蟲的牛兔血清47份、自然感染肝片吸蟲的牛羊血清6份、人工感染蛔蟲的豬血清6份、自然感染的旋毛蟲病豬血清2份及弓形蟲病豬血清4份。觀察RAg-T-DIGFA方法與感染其他寄生蟲家畜的抗體之間有無交叉反應(yīng)。

重復(fù)性及穩(wěn)定性試驗(yàn)。不同時(shí)間制作3批次重組抗原膠體金診斷試劑，測定自然感染、人工感染血吸蟲陽性牛、豬、兔血紙樣品25份及血吸蟲陰性牛、羊、豬、兔血紙樣品40份，判定的陽性符合率和陰性符合率。同批次生產(chǎn)的膠體金診斷試劑一部分放置室溫保存，另一部分置4～8℃冰箱保存。間隔不同時(shí)間(第1個(gè)月每周測定1次，第2個(gè)月每15 d測定1次，第3個(gè)月后每個(gè)月測定1次)測定血吸蟲病陽性及陰性血紙各20頭份，觀察診斷試劑在不同溫度、不同時(shí)間保存的有效性。

與T-DIGFA方法的比較試驗(yàn)。T-DIGFA按照盧福莊等［3］報(bào)道的方法進(jìn)行檢測。共檢測牛血紙樣本136份，比較兩者的符合率。

各地臨床采集樣品的檢測結(jié)果。由黑龍江、浙江、湖北、四川等地采集血紙片118份，用RAg-T-DIGFA法檢測。

2 結(jié)果和分析

2.1 重組蛋白的純化

用谷胱甘肽瓊脂糖凝膠親和層析純化的重組蛋白GST-Sj22.6經(jīng)SDS-PAGE和 Western blot方法檢測具有良好的免疫原性(圖1)，通過Dnastar軟件包分析其分子量為49.7 kD，等電點(diǎn)為6.48。經(jīng)分光光度計(jì)檢測其濃度為2.44 mg·mL－1。

圖1 重組蛋白GST-Sj22.6的Western-blot分析

2.2 RAg-T-DIGFA最佳實(shí)驗(yàn)條件的確定

經(jīng)過篩選重組抗原標(biāo)記用量和標(biāo)記 pH，確定100 mL制備好膠體金溶液中用0.25 mol K2CO3350 μL標(biāo)記重組抗原用量為320 μL即0.781 mg。在室溫22℃時(shí)，在含終濃度為0.05%Tween-20，1%BSA，0.1% 疊 氮 鈉 的 pH 5.91、pH 6.24、pH 6.47、pH 6.64的PBS中選擇 pH 6.24的 PBS作為洗滌液。

2.3 敏感性及特異性

用RAg-T-DIGFA法檢測人工感染血吸蟲尾蚴牛、兔血紙片，檢測出人工感染血吸蟲尾蚴28 d和21 d以上的陽性牛和兔血紙抗體。可以檢測出經(jīng)解剖沖蟲法確診感染1對血吸蟲的牛血紙。用RAg-T-DIGFA法檢測各類血清抗體，檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)與肝片吸蟲、蛔蟲、弓形蟲、旋毛蟲病血清之間無交叉反應(yīng)見表1。

2.4 重復(fù)性及穩(wěn)定性

3個(gè)批次制備的重組抗原膠體金試劑血吸蟲陽性血紙樣品25份及血吸蟲陰性血紙樣品40份，判定的陽性符合率和陰性符合率均完全相同。說明該方法的重復(fù)性良好。同一批血吸蟲抗原膠體金在4～8℃保存期6個(gè)月仍有效，室溫保存期為3個(gè)月。說明RAg-T-DIGFA試劑盒的穩(wěn)定性良好。

表1 RAg-T-DIGFA對各類血清抗體檢測結(jié)果

2.5 與T-DIGFA方法的比較

RAg-T-DIGFA和T-DIGFA方法共檢測血紙陽品136份，結(jié)果陰性符合率和陽性符合率均為100%。

2.6 RAg-T-DIGFA的臨床樣品檢測

共檢測各地血紙樣品118份，檢出陽性血樣6份，陽性率達(dá)到5.08%(表2)。

表2 RAg-T-DIGFA的臨床樣品檢測結(jié)果

3 小結(jié)與討論

本研究建立的重組抗原金標(biāo)免疫滲濾法是在二步金標(biāo)免疫滲濾法的基礎(chǔ)上首次將基因重組技術(shù)獲得的重組抗原應(yīng)用在二步金標(biāo)免疫滲濾法上，解決了抗原獲得周期長的問題，同時(shí)該法具有抗原容易制備的特點(diǎn)。

日本血吸蟲重組抗原rGST-Sj22.6與蟲卵抗原相比具有抗原穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)，純化透析完成的重組抗原可以在20℃保存2年以上，可以用于二步金標(biāo)免疫滲濾法。金標(biāo)免疫滲濾法是一種快速簡便的診斷方法，已應(yīng)用于人血吸蟲病的血清學(xué)診斷［4－7］。

構(gòu)建完成重組質(zhì)粒后重組抗原的制備過程自動(dòng)化程度高、制備時(shí)間短，可利用發(fā)酵罐大量制備，在兩個(gè)星期中可以純化制備500 mg左右的重組抗原，價(jià)格低廉，與日本血吸蟲人工感染家兔的方法獲得的蟲卵抗原相比節(jié)約時(shí)間和成本。同時(shí)，重組抗原是抗原基因在菌體中表達(dá)的蛋白質(zhì)抗原，多以大腸桿菌為表達(dá)菌株，除工程菌成份外，其他雜質(zhì)少，而且無傳染性。

RAg-T-DIGFA具有良好的敏感性、特異性、重復(fù)性和穩(wěn)定性等特點(diǎn)，同時(shí)操作簡便，檢測周期短，檢測10份樣品僅需約10 min，便于在基層推廣使用。

雖然重組抗原經(jīng)過用谷胱甘肽瓊脂糖凝膠親和層析純化，但是仍有少量的大腸桿菌菌體蛋白存在，可能是影響RAg-T-DIGFA與T-DIGFA相比所用抗原量較多的原因。

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