結締組織生長因子在高糖誘導的足細胞上皮間充質轉化中的作用*

戴厚永，湯日寧，鄭 敏，倪 杰，馬坤嶺，劉必成△

(1東南大學附屬中大醫院腎內科，江蘇 南京 210009;2南通大學附屬醫院腎內科，江蘇 南通 226001)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最常見的慢性微血管并發癥之一，也是尿毒癥透析的主要病因。研究表明，足細胞在DN的進展過程中起重要作用［1－2］。近年來研究顯示在高糖及轉化生長因子 β(transforming growth factorβ，TGF － β)等作用下，足細胞發生上皮間充質轉分化(epithelialmesenchymal transition，EMT)，導致腎小球濾過屏障發生障礙引起蛋白尿［3－4］。已有大量證據表明結締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)參與DN的發生和發展［5－6］，但有關其在糖尿病足細胞病變，尤其是EMT中的作用還不很清楚。本研究旨在探討CTGF在高糖環境下，足細胞發生EMT時所起的作用，為防治DN提供理論依據。

材料和方法

1 足細胞培養

小鼠永生系足細胞為美國阿爾伯特愛因斯坦醫學院Peter Mundel教授惠贈，南京醫科大學張愛華教授轉贈。培養方法參照文獻［7］:將復蘇的足細胞接種至涂有Ⅰ型膠原的25 cm2培養瓶，用含10% 胎牛血清的RPMI－1640培養基［添加重組小鼠γ干擾素(γ－interferon，γ －IFN)1×104U/L，Gibco］在 33℃條件下培養，隔天換液，此時足細胞處于未分化狀態，細胞增殖，當細胞長至85%左右融合時，予以0.25%胰蛋白酶消化傳代。誘導分化時，將未分化足細胞置于37℃條件下(不含γ－IFN)繼續培養培養10 d，即為分化成熟的足細胞，用分化好的足細胞進行實驗。

2 實驗分組

將在分化條件下的足細胞分為正常葡萄糖(glucose solution，GS)(5 mmol/L)培養組、正常葡萄糖+CTGF(重組人 CTGF 50 μg/L［8］，PeproTech)組、高糖(30 mmol/L)培養組和高糖+CTGF組，在37℃條件下刺激24 h。同時采用甘露醇作為滲透壓對照組(5 mmol/L葡萄糖+25mmol/L甘露醇)。根據是否加抗 CTGF抗體，進一步分為正常葡萄糖培養組(5 mmol/L)、高糖培養組(30 mmol/L)和高糖+抗CTGF(10 mg/L，Santa Cruz，于葡萄糖刺激前2 h給予［9］)培養組，用于研究抗CTGF抗體對高糖培養的足細胞的作用。所有實驗重復3次，結果取其平均值。

3 形態學觀察

根據實驗設計，從培養箱中取出足細胞，在超凈臺下，吸取培養瓶上清液，PBS清洗2次，更換新鮮培養液后，旋緊培養瓶，放置于倒置顯微鏡下，觀察細胞形態變化，用數碼相機進行拍照。

4 實時熒光定量RT－PCR

用RNAiso Plus試劑(TaKaRa)提取腎皮質總RNA，具體操作按說明書進行。將提取的RNA用SYBR ExScriptTMRT－PCR試劑盒(TaKaRa)進行反轉錄成cDNA，取2 μL cDNA加入前引物、后引物及SYBR預混液等共 20 μL體系在 ABI PRISM 7300PCR儀(Applied Biosystems)進行擴增。所需引物序列如下:

β－actin上游引物 5'－CCTCTATGCCAACACAGTGC －3'，下游引物 5'－GTACTCCTGCTTGCTGATCC－3';nephrin上游引物5'－CCCAGGTACACAGAGCACAA －3'，下游引物 5'－CTCACGCTCACAACCTTCAG－3';desmin上游引物5'－TGCAGCCACTCTAGCTCGTA －3'，下游引物 5'－GACATGTCCATCTCCACCTG － 3'。采用 2－ΔΔCt法計算目的基因mRNA的含量。

5 Western blotting

細胞培養完畢，用PBS洗2遍，加適量裂解液用細胞刮刮取細胞使其脫落裂解，后收集裂解液常規離心，取上清液檢測蛋白濃度。取20 μg蛋白變性后SDS－PAGE凝膠電泳，轉入PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，0.3%TBST洗膜3次，分別加入羊抗nephrin和羊抗 desmin多克隆抗體(Santa Cruz，1∶200)，4℃過夜。TBST洗膜，加入辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗兔抗山羊 IgG(Boster，1∶1000)室溫孵育 1 h，PBS洗膜3次，ECL化學發光法曝光。用β－actin作為內參照，以目的蛋白與β－actin蛋白的灰度值表示蛋白的相對表達水平。

6 統計學處理

結 果

1 CTGF在高糖誘導的足細胞表型改變中的作用

正常培養條件下(5 mmol/L葡萄糖)，分化成熟的足細胞呈現上皮細胞的特點，顯微鏡下觀察到典型的“樹枝狀”改變，見圖1A。高糖環境下，足細胞形態發生改變，呈現“鵝卵石”樣外觀，見圖1C。CTGF與高糖共同培養足細胞加劇其表型改變，細胞進一步呈現梭形，胞體拉長，見圖1D。然而CTGF與正常葡萄糖共同培養足細胞，未引起明顯形態學變化，見圖1B。

Figure 1.The morphology analysis of podocytes under different culture conditions(×200).A:podocytes cultured with 5 mmol/L GS;B:5 mmol/L GS supplemented with CTGF;C:30 mmol/L GS;D:30 mmol/L GS supplemented with CTGF.圖1 不同培養條件下足細胞形態學觀察結果

2 CTGF對高糖作用下足細胞上皮細胞標志物nephrin的作用

如圖2所示，與正常對照組相比，高糖誘導足細胞nephrin mRNA和蛋白表達減少(P＜0.05)。CTGF與高糖共同培養足細胞后nephrin表達進一步減少，表明CTGF和高糖對足細胞的nephrin表達有協同作用(P＜0.05)。滲透壓對照組的nephrin mRNA和蛋白表達水平與正常葡萄糖培養組相比無顯著差異(P＞0.05)。

Figure 2.The effect of CTGF on nephrin expression in podocytes under different conditions.A:the result of real－ time RT － PCR;B:the Western blotting analysis.1:podocytes cultured with 5 mmol/L GS;2:5 mmol/L GS supplemented with CTGF(50 μg/L);3:30 mmol/L GS;4:30 mmol/L GS supplemented with CTGF;5:5 mmol/L GS supplemented with 25 mmol/L mannitol..n=3.#P ＜0.05 vs group 1;△P ＜0.05 vs group 3.圖2 CTGF對不同培養條件下足細胞nephrin表達的影響

3 CTGF對高糖作用下足細胞間充質標志物desmin的作用

Real－time RT－PCR檢查結果顯示，高糖(30 mmol/L)刺激足細胞24 h后，desmin mRNA表達水平較正常糖(5 mmol/L)培養增加約2.5倍(P＜0.05)，見圖3A，加入CTGF后，desmin mRNA表達進一步增加(P＜0.05)。在蛋白水平檢測也得到與基因表達相類似的結果，見圖3B。以上結果表明了外源性CTGF與高糖協同作用使足細胞間充質標志物desmin表達增加。

Figure 3.The effect of CTGF on desmin expression in podocytes under different conditions.A:the result of real－ time RT － PCR;B:the Western blotting analysis.1:podocytes cultured with 5 mmol/L GS;2:5 mmol/L GS supplemented with CTGF(50 μg/L);3:30 mmol/L GS;4:30 mmol/L GS supplemented with CTGF;5:5 mmol/L GS supplemented with 25 mmol/L mannitol..n=3.#P ＜0.05 vs group 1;△P ＜0.05 vs group 3.圖3 CTGF對不同培養條件下足細胞desmin表達的影響

4 CTGF對正常糖培養足細胞EMT有關指標的影響

為了解正常培養情況下，CTGF對足細胞的表型改變以及EMT相關指標有無影響，將CTGF與足細胞共同培養。與未加CTGF組相比，未發現明顯形態學改變，見圖1B。上皮細胞標志物nephrin mRNA和蛋白表達水平與對照組相比未有明顯差異(P＞0.05)，見圖2。間充質細胞標志物desmin檢測也獲得相同的結果(P＞0.05)，見圖3。以上結果表明正常糖(5 mmol/L)環境下，體外培養時CTGF不足以引起足細胞發生EMT。

5 阻斷CTGF對高糖誘導的足細胞EMT的影響

為進一步研究CTGF在高糖引起的足細胞EMT中的作用，將抗CTGF抗體加入高糖培養基，與未加抗CTGF抗體培養組相比，其能部分逆轉足細胞EMT，即部分足細胞又恢復上皮細胞樣變化，重新呈現“樹枝狀”，見圖4C。實時熒光定量RT－PCR檢測結果顯示，抑制CTGF后desmin表達下調(P＜0.05)，而 nephrin表達上調(P＜0.05)，見圖 4D。Western blotting檢測結果進一步支持了以上結果，見圖4E、F。以上結果顯示抑制CTGF能部分阻斷高糖誘導的足細胞EMT過程。

Figure 4.Effects of anti－CTGF antibody on high glucose－induced EMT in podocytes(×200).The morphology of podocytes cultured with 5 mmol/L GS(A)，30 mmol/L GS(B)and 30 mmol/L GS supplemented with anti－CTGF antibody(C)was observed.D:the result of real－ time RT － PCR;E，F:the Western blotting.β － actin was used as control.1:5 mmol/L GS;2:30 mmol/L GS;3:30 mmol/L GS supplemented with anti－CTGF antibody..n=3.#P＜0.05 vs group 1;△P＜0.05 vs group 2.圖4 抗CTGF抗體對高糖誘導的足細胞EMT的作用

討 論

近年來，足細胞損傷成為 DN研究領域的熱點［1－2，10］。在相關損傷因子作用下，足細胞損傷后會發生EMT，表現為上皮細胞標志物如nephrin、ZO－1和P－cadherin等表達下調，而間充質細胞標志物desmin、成纖維細胞特異性蛋白－1(fibroblast－specific protein－1，FSP－1)、基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase－9，MMP－9)和 fibronectin等表達上調［3］。本研究以上皮細胞標志物nephrin和間充質細胞標志物desmin為觀測指標，發現高糖本身能引起足細胞發生EMT，表現為nephrin減少，desmin增加;CTGF與高糖有協同作用，進一步促進EMT的發生。有趣的是，CTGF本身在正常糖環境下，并不導致足細胞發生EMT，而用抗CTGF抗體能阻斷高糖誘導的足細胞EMT。

CTGF是CCN家族的重要成員，由4個功能模塊組成，是一重要的細胞外基質蛋白，在細胞生長、血管生成、細胞黏附、凋亡、傷口愈合、細胞外基質的合成以及器官纖維化等多方面發揮重要作用［11］。研究顯示CTGF在DN中發揮重要作用。Ito等［12］最早利用原位雜交方法檢測DN患者腎組織，發現腎小球、腎小球毛細血管外區域、系膜增生區CTGF mRNA表達顯著增加，且與腎損傷程度呈正相關。動物實驗發現阻斷CTGF能夠減輕DN蛋白尿，改善預后［13］。目前認為CTGF是糖尿病腎損傷的重要生物標志物和治療目標［14－15］。我們體外實驗結果顯示抗CTGF抗體能抑制足細胞EMT，表明抑制CTGF有足細胞保護作用。

Roestenberg等［16］發現，正常情況下腎組織 CTGF主要表達于足細胞和壁層上皮細胞，而系膜細胞表達較少;在DN時，CTGF最先在足細胞升高然后才是系膜細胞，顯示了CTGF與足細胞病變之間的關系。Yokoi等［17］將足細胞過度表達CTGF的轉基因小鼠誘導糖尿病后，發現其蛋白尿水平較未過表達CTGF的對照組糖尿病小鼠明顯增加，足細胞病變和系膜基質擴張也更加明顯，這一發現為CTGF在體內引起足細胞損傷提供了直接證據。然而有趣的是，盡管轉基因小鼠腎小球CTGF蛋白表達水平是非轉基因小鼠的5倍，但此時腎組織結構檢查卻正常，表明單純CTGF過度表達不足以致病。將CTGF基因轉染給其它組織細胞如肝、心和肺等也得到相類似的結果，由此認為CTGF在致纖維化病變過程中是起調節作用而不是直接致纖維化作用［18］。與此研究結果一致，我們用CTGF直接刺激足細胞未引起足細胞EMT也證實CTGF單獨作用有限。此外，我們發現CTGF與高糖有協同作用，促使足細胞EMT加劇，表明CTGF在高糖誘導的足細胞EMT過程中起調節作用。

總之，更好地理解高糖環境下足細胞CTGF的作用途徑和闡明其中的信號通路，能為更特異性地防治DN提供有力的武器。

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