高糖對大鼠晚期內皮祖細胞增殖、遷移、黏附及分泌功能的影響*

李 巖， 唐可欣， 李 宏， 張 杰， 成 敏

(濰坊醫學院，山東 濰坊 261053)

糖尿病是臨床常見病和多發病，而血管病變是其慢性并發癥的主要表現，嚴重影響著糖尿病患者的預后和生活質量。研究顯示糖尿病血管并發癥的發生與內皮功能受損密切相關［1］，因此減少血管內皮損傷，對防治糖尿病血管并發癥的發生及發展具有重要的臨床意義。

內皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是一類能分化為血管內皮細胞的前體細胞［2］。EPCs可以歸巢到內皮損傷及缺血部位，維持血管內皮組織的完整性［3］。近年來的研究發現，根據EPCs的來源、形態、增殖能力、分化能力以及基因表達、功能等方面的不同，可將EPCs分為早期EPCs和晚期EPCs兩種類型［4－5］。晚期 EPCs因其典型的內皮細胞形態和高增殖潛力被認為是真正的EPCs，在臨床應用方面極具前景［6］。

文獻證實，糖尿病患者特別是合并有血管疾病的糖尿病患者外周血中EPCs的數量減少［7－8］。而糖尿病是一種以高血糖為主要特征的代謝性疾病。因此，有必要進一步研究高糖對晚期EPCs功能的影響。本研究探討了體外培養條件下，不同濃度葡萄糖對晚期EPCs增殖、遷移、黏附能力及分泌單核細胞趨化蛋白－1(monocyte chemoattractant protein－1，MCP－1)、白細胞介素 －8(interleukin－8，IL－8)的影響，旨在深入了解糖尿病血管合并癥的發病機制，為其臨床治療提供實驗依據。

材料和方法

1 材料與試劑

雄性SD大鼠，體重100～150 g(中國人民解放軍第89醫院實驗動物中心);血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)及堿性成纖維生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)(Peprotech);M199(Gibco);胎牛血清(杭州四季青生物公司);HISTOPAQUE－1083、MTT及 FITCUEA－1(Sigma);Dil－ac－LDL(MolecularProbe);FITC－CD133及PE－VEGFR－2(BD);50%葡萄糖(濟南利民制藥有限責任公司);人纖維連接蛋白(Chemicon);改良的Boyden小室(江蘇海門麒麟醫用儀器廠);大鼠MCP－1及IL－8 ELISA試劑盒(上海凱博生物有限公司)、Trizol(Invitrogen)，TaKaRa RNA PCR kit(AMV)3.0(大連寶生物工程有限公司)。引物由上海生物工程有限公司合成。

2 EPCs的分離、培養和鑒定

2.1 EPCs的分離培養 頸椎脫臼法處死大鼠，75%乙醇浸泡10 min，剪后肢，去皮，入超凈臺剔除肌肉組織，暴露骨髓腔，粗端插20號針頭沖洗液沖洗至無色。將骨髓細胞懸液以1000 r/min離心5 min，棄上清，沉淀用PBS制成懸液，以3∶4比例輕置于分離液表面，2000 r/min離心30 min，吸取中間白色細胞層，加5 mL PBS洗滌2次(1400 r/min離心5min)，棄上清，用完全 M199 培養液(含 15%FBS、VEGF 10 μg/L、bFGF 5 μg/L)重懸，將其接種于預先包被有人纖維連接蛋白的培養瓶中，置37℃含5%CO2及飽和濕度的培養箱中培養。4 d后更換培養液。

2.2 EPCs的鑒定

①細胞染色與鑒定 將培養7 d的細胞以0.25%胰酶/0.02%EDTA消化，接種于蓋玻片上，細胞爬片成功后，加入2.4 mg/L DiI－ac－LDL，37℃避光孵育1 h，2%多聚甲醛固定10 min，PBS液漂洗后加入10 mg/L FITC－UEA－1避光孵育1 h，PBS液漂洗后在熒光顯微鏡下觀察。

②基因鑒定 取培養第3代的EPCs，檢測內皮細胞標志物 von Willebrand因子(von Willebrand factor，vWF)和血管內皮型鈣黏蛋白(vascular endothelial cadherin，VE－cadherin)mRNA的表達。用 Trizol抽取細胞總 RNA，采用 TaKaRa RNA PCR kit(AMV)3.0試劑盒合成cDNA。vWF:上游引物5'－GCGTGGCAGTGGTAGAGTA －3'，下游引物 5'－GGAGATAGC GGGTGAAATA －3'，擴增片段245 bp。PCR 反應條件:94 ℃預變性2 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72℃ 30 s，共35個循環。VE－cadherin:上游引物5'－CCACTGTGCTGATCAGATTGGAA －3'，下游引物 5'－GAGGCTCATCTGGGTCCTCAAC －3'，擴增片段 141 bp。PCR反應條件:94℃預變性2 min，94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，共35個循環。內參 GAPDH:上游引物5'－GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG－3'，下游引物5'－ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA －3'，擴增片段143 bp。PCR產物以3%瓊脂糖凝膠電泳檢測，長波紫外燈下觀測照相。

③流式細胞檢測 將第3代的細胞消化制成單細胞懸液并計數，取1×106細胞行CD133－FITC(1∶50)及VEGFR－2－PE(1∶100)染色，另取1×106細胞加入同型對照，4℃避光孵育30 min。染色完畢后利用流式細胞儀檢測CD133及VEGFR－2的表達。應用Cell Quest軟件進行分析。

3 實驗分組

選取第3代EPCs作為靶細胞。細胞隨機分為:(1)正常對照組:葡萄糖濃度為 5 mmol/L［9］;(2)高濃度葡萄糖組:葡萄糖濃度分別為10﹑20和40 mmol/L;(3)高滲透壓對照組:5 mmol/L葡萄糖+35 mmol/L 甘露醇［10］。

4 MTT實驗

取對數生長期的細胞，消化后以完全培養液重懸，以3000 cells/well的密度接種于96孔板，細胞貼壁后按分組給予不同濃度葡萄糖。葡萄糖干預48 h后在每孔(含100 μL培養液)中加入10 μL MTT溶液(5 g/L)，4 h后小心吸棄上清，每孔加150 μL DMSO振搖10 min，酶標儀(波長490 nm處)測其A值。每組設4個復孔。

5 遷移實驗

按上述方法收集貼壁細胞并計數。將200 μL培養液和VEGF(50 μg/L)加入改良的Boyden小室的下室，2×104EPCs懸浮液注入上室，24 h后，刮去濾膜上面的未移動細胞，PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定，DAPI染色，顯微鏡下隨機選取5個視野(×200)，計數遷移細胞，取其平均數。

6 黏附實驗

細胞消化后，按照3×107/L接種于6孔板，待細胞長至融合狀態時，不同濃度葡萄糖(5、10、20和40 mmol/L)干預 48 h后以 0.25% 胰酶/0.02%EDTA消化，收集細胞。然后將同等數目的EPCs接種在包被有人纖維連接蛋白的培養板中，37℃下培養30 min，PBS洗滌去除未貼壁細胞，顯微鏡下隨機選取9個視野(200倍)，計數貼壁細胞，取其平均數。

7 ELISA

細胞消化后，按照3×107/L接種于6孔板，待細胞長至融合狀態時，以不同濃度葡萄糖(5、10、20和40 mmol/L)干預48 h后收集細胞培養上清，按說明書操作，測定上清中MCP－1和IL－8含量。具體方法如下:將100 μL不同濃度標準品或樣品加至已包被有抗體的酶標板中，空白對照孔中加入稀釋液100 μL，37℃孵育150 min;洗滌后加入酶標抗體，37℃孵育60 min;反應完成后，顯色;顯色終止后在492 nm處行酶標儀掃描檢測。

8 統計學處理

實驗重復3～4次。采用SPSS 13.0進行統計分析，數據以均數±標準差()表示。組間差異采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD－t檢驗。

結 果

1 EPCs的培養與鑒定

剛分離的單個核細胞大多呈懸浮生長，培養4 d后，貼壁細胞數量增多且呈梭形，培養7 d的細胞有集落樣結構出現，傳至第3代(培養21 d)的細胞呈明顯鋪路石樣外觀，見圖1。培養7 d的細胞經DiI－ac－LDL和 FITC －UEA －1染色，83.5% ±9.2%的細胞為雙熒光染色陽性［紅色熒光為ac－LDL陽性細胞，綠色熒光為UEA－1陽性細胞，雙熒光陽性(黃色)細胞被認為是正在分化的EPCs］，見圖2。第3代EPCs，RT－PCR結果顯示:內皮細胞標志物vWF和VE－cadherin表達陽性，見圖3。FASC結果顯示:干細胞標志物CD133陽性細胞率為8.3% ±1.2%，內皮細胞標志物VEGFR－2陽性細胞率為87.6% ±8.2%，見圖 4。

Figure 1.Morphology of EPCs from bone marrow(×100).A:four days after plating;B:seven days after plating;C:twenty－one days after plating.圖1 培養不同時期EPCs的形態學觀察(×100)

Figure 2.Characterization of early EPCs from bone marrow observed under fluorescent microscope(×200).A:DiI－ac－LDL;B:FITC－UEA－1;C:DiI－ac－LDL+FITC－UEA－1.圖2 熒光顯微鏡鑒定早期EPCs

Figure 3.The mRNA expression of vWF and VE－cadherin in late EPCs(RT－PCR).Marker:TaKaRa DL500 DNA marker，containing 7 DNA fragments:500 bp，400 bp，300 bp，200 bp，150 bp，100 bp and 50 bp.vWF:245 bp;VE －cadherin:141 bp;GAPDH:143 bp.圖3 RT－PCR鑒定體外培養的晚期EPCs

Figure 4.Expression of CD133 and VEGFR－2 on late EPCs(FACS).圖4 FACS鑒定體外培養的晚期EPCs

2 高糖對EPCs增殖、遷移及黏附的影響

與正常葡萄糖處理組(5 mmol/L)相比，高濃度葡萄糖干預可濃度依賴性抑制晚期EPCs的增殖及遷移能力(P＜0.05，P＜0.01)，而高滲透壓對照組與5 mmol/L葡萄糖組相比無顯著差異，見圖5、6。高濃度葡萄糖亦抑制晚期EPCs的黏附能力，與正常葡萄糖處理組(5 mmol/L)相比，40 mmol/L葡萄糖處理明顯降低晚期EPCs的黏附能力(P＜0.05)，而高滲透壓對照組與5 mmol/L葡萄糖組相比無顯著差異，見圖7。

Figure 5.The effects of high glucose on the proliferation of late EPCs.1:5 mmol/L glucose;2:10 mmol/L glucose;3:20 mmol/L glucose;4:40 mmol/L glucose;5:5 mmol/L glucose+35 mmol/L mannitol..n=3.*P＜0.05 vs 5 mmol/L glucose.圖5 高糖對晚期EPCs增殖能力的影響

Figure 6.The effects of high glucose on the migration of late EPCs.1:5 mmol/L glucose;2:10 mmol/L glucose;3:20 mmol/L glucose;4:40 mmol/L glucose;5:5 mmol/L glucose+35 mmol/L mannitol..n=3.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs 5 mmol/L glucose.圖6 高糖對晚期EPCs遷移能力的影響

Figure 7.The effects of high glucose on the adhesion of late EPCs.1:5 mmol/L glucose;2:10 mmol/L glucose;3:20 mmol/L glucose;4:40 mmol/L glucose;5:5 mmol/L glucose+35 mmol/L mannitol..n=3.*P ＜0.05 vs 5 mmol/L glucose.圖7 高糖對晚期EPCs黏附能力的影響

3 高糖對EPCs分泌炎癥介質MCP－1及IL－8的影響

晚期EPCs經不同濃度的葡萄糖孵育后，10 mmol/L葡萄糖處理組其細胞培養上清中MCP－1及IL－8含量與正常葡萄糖處理組(5 mmol/L)相比無顯著差異(P＞0.05)。而在 20 mmol/L及40 mmol/L葡萄糖處理組，細胞上清中炎癥介質MCP－1及IL－8的含量明顯高于正常葡萄糖處理組(P＜0.05)，而高滲透壓對照組與5 mmol/L葡萄糖組相比無顯著差異，見圖8、9。

Figure 8.The effects of high glucose on the secretion of MCP－1 in late EPCs.1:5 mmol/L glucose;2:10 mmol/L glucose;3:20 mmol/L glucose;4:40 mmol/L glucose;5:5 mmol/L glucose+35 mmol/L mannitol..n=4.*P ＜0.05 vs 5 mmol/L glucose.圖8 高糖對晚期EPCs分泌MCP－1的影響

Figure 9.The effects of high glucose on the secretion of IL－8 in late EPCs.1:5 mmol/L glucose;2:10 mmol/L glucose;3:20 mmol/L glucose;4:40 mmol/L glucose;5:5 mmol/L glucose+35 mmol/L mannitol..n=4.*P ＜0.05 vs 5 mmol/L glucose.圖9 高糖對晚期EPCs分泌IL－8的影響

討 論

隨著對EPCs研究的不斷深入，有學者指出:EPCs可分為早期EPCs及晚期EPCs。早期EPCs增殖能力有限、不能傳代培養，表達 CD133、CD34、CD45等造血干細胞標志，但內皮細胞特異性的表面標志表達不高。晚期EPCs增殖能力強，能傳代生長大概12周左右且專一地表達一些內皮細胞的標志物，如 VEGFR －2、VE － cadherin、vWF 等［11］。一般認為培養7 d內的EPCs為早期EPCs，而能形成集落并可傳代培養的EPCs為晚期EPCs［12］。本研究結果顯示:傳至第3代的EPCs高表達內皮細胞特異性的表面標志VEGFR－2、VE－cadherin、vWF等，但干細胞標志CD133的表達量極低，提示后續實驗所采用的靶細胞為晚期EPCs。

正常情況下，骨髓EPCs來源的內皮細胞占所有新形成的內皮細胞的25%［13－14］。但在糖尿病患者，EPCs數量減少、功能降低，然而其內在機制尚不明晰。基于糖尿病是一種以高血糖為主要特征的代謝性疾病。故有必要深入探討高糖對EPCs，特別是晚期EPCs功能的影響。本研究結果顯示:與正常葡萄糖組相比，高糖處理明顯抑制了晚期EPCs的增殖能力，這可能涉及到以下機制:(1)高糖可顯著促進細胞的凋亡，加速其衰老［15］;(2)高糖通過自由基攻擊膜蛋白及胞內的核酸和酶系統，使細胞增殖率下降［16］。另外，在實驗中我們發現，由于高糖的毒性作用，晚期EPCs的遷移、黏附能力亦受損，這必將影響受損血管的再內皮化，在一定程度上影響著糖尿病血管并發癥的發生、發展［17］。

MCP－1及 IL－8是兩種重要的趨化蛋白。MCP－1是趨化因子CC家族的一個主要成員，而IL－8屬于趨化因子CXC家族，前者具有誘導單核細胞趨化及激活單核細胞的雙重功能，后者能夠吸引中性粒細胞，在動脈粥樣斑塊中的表達量與新生血管的生成及巨噬細胞的聚集呈正相關［18］。有文獻證實高糖可促進成熟內皮細胞MCP－1及IL－8表達，誘導中性粒細胞、單核細胞向血管內皮聚集，從而導致血管內皮系統功能的損害，引起動脈粥樣硬化等糖尿病血管并發癥［19－20］。另外，亦有文獻表明培養的EPCs，特別是晚期EPCs可合成、分泌MCP－1、IL－8等炎癥介質［21］。本研究結果顯示:高糖可促進內皮細胞的前體細胞——EPCs合成、分泌MCP－1及IL－8，這一發現有助于解釋動脈粥樣硬化等糖尿病血管并發癥的發病機制及進展過程。

在當前的研究中，我們發現高糖不僅抑制EPCs的增殖、遷移和黏附，還促進MCP－1及IL－8的釋放。高糖的這種毒性作用可能是當糖尿病患者血糖控制不良時，導致患者易發生血管病變及傷口不易愈合的重要原因。因此，糖尿病患者應嚴格控制血糖，以改善EPCs的功能，從而保證對血管內皮損傷及時修復，以防止糖尿病血管合并癥的發生和延緩其發展。

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