靶向PERK基因的shRNA真核表達載體的構建及對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激狀態(tài)下L02肝細胞凋亡的影響*

曹 潔，楊朝霞△，沈 薇△，姚 隆

(1重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院消化科，重慶 400010;2江津區(qū)中心醫(yī)院重癥醫(yī)學科，重慶 402260)

PERK［RNA－dependent protein kinase(PKR)－like endoplasmic reticulum kinase］是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的Ⅰ型跨膜蛋白，N端位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，非應激時與葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(glucose－regulated protein，GRP)78形成復合物，C端位于胞質(zhì)，具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)狀態(tài)下，PERK與GRP78解離，發(fā)生自身聯(lián)合，自身磷酸化而激活，激活的PERK磷酸化真核翻譯起始因子－2的α亞基(eIF2－α)51位的絲氨酸，從而阻斷蛋白合成，降低了去往內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白量，最終減輕了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的負擔，但是磷酸化的eIF2－α卻可以選擇性增加活化轉(zhuǎn)錄因子4(activating transcription factor 4，ATF4)mRNA的表達，繼而上調(diào)促凋亡因子CHOP的表達，從而誘導細胞凋亡［1］。已有研究證實，在ERS狀態(tài)下，PERK基因在鼠 INS－1細胞［2］和鼠H4IIE細胞［3］凋亡的過程中發(fā)揮了重要的作用，但是有關PERK基因與ERS狀態(tài)下人肝細胞凋亡的關系鮮有報道。為此，本實驗將構建靶向人PERK基因的短發(fā)夾狀RNA(short hairpin RNA，shRNA)表達載體，并轉(zhuǎn)染人正常肝細胞株 L02，沉默PERK基因，同時用毒胡蘿卜素(內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上鈣泵抑制劑，thapsigargin，TG)誘導細胞發(fā)生ERS反應，觀察肝細胞凋亡的變化，旨在為進一步研究PERK基因及其相關的信號通路在ERS誘導肝細胞凋亡過程中的作用和機制打下基礎。

材料和方法

1 材料

1.1 質(zhì)粒和菌株 pGenesil－1.1質(zhì)粒載體購自武漢晶賽生物技術公司，大腸桿菌E.coli DH5α由重慶醫(yī)科大學附屬二院肝病研究所提供。

1.2 細胞株 人正常肝細胞株L02細胞由本消化科實驗室提供。

1.3 主要試劑 T4 DNA連接酶、DNA Fragment Purification Kit.2.0 試劑盒、MiniBEST Plasmid Purification Kit.2.0 試劑盒、PrimeScriptTMRT Reagent Kit試劑盒(TaKaRa);Poly JetTM轉(zhuǎn)染試劑(SignaGen);RPMI－1640培養(yǎng)基(Gibco);胎牛血清(杭州四季青生物公司);兔抗PERK多克隆抗體(Santa Cruz);PCR引物由大連TaKaRa公司合成;MIT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒、Annexin V－PE/7－AAD細胞凋亡檢測試劑盒(凱基生物有限公司)。

2 方法

2.1 shRNA真核表達載體序列的設計 根據(jù)Gen-Bank提供的人PERK基因序列(NM－004836)，利用Ambion公司的在線設計軟件(http://www.Ambion.com)，并參考哺乳動物真核細胞siRNA的TuschlAA－19nt設計原則，設計針對人PERK基因mRNA的靶位點序列，包括3個特異匹配位點和1個隨機錯配的寡核苷酸片段。根據(jù)載體特性，合成發(fā)夾結構shRNA對應的DNA序列。BLAST檢索設計的DNA片段序列的特異性，排除陰性對照序列與人體其它任何mRNA有同源性。序列由武漢晶賽生物技術公司合成。shRNA轉(zhuǎn)錄模板DNA的結構模式為:CACC+正義序列+莖環(huán)序列+反義序列+終止信號+SacⅠ酶切位點。

轉(zhuǎn)錄模板DNA序列如下:PERK1－1.1－A:5'－CACC GCTTTGGAATCTGTCACTAATTTCAAGACGATT AGTGACAGATTCCAAAGCTTTTTTG－3';PERK1－1.1－B:5'－AGCTCAAAAAAGCTTTGGAATCTGTCACTAATCGTCTTGAAATTAGTGACAGATTCCAAAGC－3';PERK2－1.1－A:5'－CACCGCCTCAAGCCATCCAACATATTCTATGGACAAATATGTTGGATGGCTTGAGGTTTTTTG－3';PERK2－1.1－B:5'－AGCTCAAAAAACCTCAAGCCATCCAACATATTTGTCCATAGAATATGTTG-GATGGCTTGAGGC －3';PERK3－1.1－A:5'－CACCGTTGTGCTAGCAACCCTAATATTCAAGACGTATTA-GGGTTGCTAGCACAACTTTTTTG－3';PERK3－1.1－B:5'－AGCTCAAAAAAGTTGTGCTAGCAACCCTAATACGTCTTGAATATTAGGGTTGCTAGCACAAC－3';HK －1.1－A:5'－CACCGACTTCATAAGGCGCATGCTTCAAGACGGCATGCGCCTTATGAAGTCTTTTTTG－3';HK －1.1－B:5'－AGCTCAAAAAAGACTTCATAAGGCGCATGCCGTCTTGAAGCATGCGCCTTATGAAGTC －3'。

2.2 shRNA真核表達載體的構建 將上述shRNA序列的模板DNA正、反義鏈退火后合成DNA片段。質(zhì)粒pGenesil－1.1經(jīng)Eco31I酶切，形成線性片段，并加以純化。稀釋退火片段分別與線性化pGenesil－1.1質(zhì)粒表達載體連接。連接反應條件:稀釋退火片段 1 μL;線性化質(zhì)粒載體 1 μL;10×ligase buffer 1 μL;T4 DNA 連接酶 1 μL;ddH2O 6 μL，37 ℃ 水浴反應過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌DH5α，篩選卡那霉素抗性克隆，挑取陽性克隆，用小提試劑盒小量提取質(zhì)粒。質(zhì)粒分別經(jīng)Sac I做酶切鑒定，在酶切鑒定中觀察到所插入的小片段后，取轉(zhuǎn)化菌液送武漢晶賽公司測序。證實序列正確后，分別命名為PERK1－shRNA、PERK2－shRNA、PERK3－shRNA及陰性對照HK－shRNA。大量擴增菌株，抽提質(zhì)粒，－20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 shRNA真核表達載體轉(zhuǎn)染L02肝細胞后綠色熒光信號觀察 L02細胞用含10%胎牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)基(含雙抗:青霉素0.0625 g/L，鏈霉素0.1 g/L)，37℃、5%CO2、飽和濕度傳代培養(yǎng)。實驗分空白對照組:即未做任何處理;陰性對照組:轉(zhuǎn)染HK－shRNA;實驗組:分別轉(zhuǎn)染 PERK1－shRNA、PERK2－shRNA和PERK3－shRNA。取對數(shù)生長期細胞，按2×108/L細胞密度接種于6孔板，待細胞融合率達70% ～80%時，將1 μg干擾質(zhì)粒和3 μL Poly JetTM轉(zhuǎn)染試劑瞬時轉(zhuǎn)染L02肝細胞，每組設3個復孔。轉(zhuǎn)染12～18 h后，培養(yǎng)液更換為完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，分別于轉(zhuǎn)染24、48 h后在倒置熒光顯微鏡下觀察增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)的表達情況。

2.4 RT－PCR法檢測PERK mRNA的表達 收集各組轉(zhuǎn)染24 h的細胞，提取細胞總RNA，檢測純度及完整性，按TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent Kit試劑盒說明書方法逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA，PCR擴增后經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)照相，Quantity One 4.52圖像分析軟件半定量分析，以PERK與β－actin的比值代表其相對含量。PERK上游引物5'－AGCACTCAGATGGAGAGAGTCAG －3'，下游引物5'－GCTATGGGAGTTGTTGGACTGT －3'，產(chǎn)物大小260 bp;β－actin上游引物5'－GACCCAGATCATGTTTGAGACC－3'，下游引物 5'－ATCTCCTTCTGCATCCTGTCG －3'，產(chǎn)物大小550 bp。

2.5 Western blotting檢測PERK蛋白的表達 收集各組轉(zhuǎn)染24 h的細胞，按總蛋白提取試劑盒說明步驟提取細胞中總蛋白，BCA法進行蛋白定量，分裝后－80℃保存，避免反復凍融。蛋白經(jīng)SDS－PAGE電泳后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，加入兔抗PERK多克隆抗體(1∶500稀釋)，再加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG(1∶5000稀釋)，ECL顯影。以β－actin為內(nèi)參照。Quntity One 4.52圖像分析軟件進行圖像分析，將每個樣本的積分吸光度值與β－actin的積分吸光度值相比，得出的比值代表其蛋白相對含量。

2.6 MTT法檢測細胞活力 L02細胞以5×107/L的細胞濃度接種于96孔板，細胞貼壁后更換培養(yǎng)基，按2.3方法將上述篩選出的最佳干擾質(zhì)粒和陰性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染L02肝細胞，分組如下:(1)正常細胞組(normal組);(2)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激模型組(TG組):即毒胡蘿卜素刺激L02細胞;(3)轉(zhuǎn)染HK－shRNA載體的肝細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激模型組(HK+TG組);(4)轉(zhuǎn)染PERK－shRNA載體的肝細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激模型組(PERK+TG組)。各組細胞轉(zhuǎn)染24 h后，更換新鮮培養(yǎng)基，加入終濃度為100 nmol/L［4］毒胡蘿卜素，孵育24 h后，每孔加入MTT(5 g/L)20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)基，每孔加入150 μL DMSO，用酶標儀在490 nm波長處檢測每孔的吸光度。每組設3個復孔，至少重復3次。

2.7 Annexin V－PE/7－AAD流式細胞術檢測細胞凋亡率 按2.6方法處理細胞后，收集各組細胞，PBS漂洗2次，用1 μL Annexin V －PE 和5 μL 7－AAD避光染色10 min后，將細胞置激發(fā)光為488 nm波長的FACS Calibur型流式細胞儀上檢測，上機測定時獲取2×105個以上細胞，重復3次。得到的數(shù)據(jù)用ModFit LT軟件分析結果。染色后將細胞分為3個亞群:活細胞胞膜完整，磷酯酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)無外化，為 Annexin V －PE－/7－AAD－亞群;早期凋亡細胞胞膜完整，PS外化，為Annexin V－PE+/7－AAD－亞群;晚期凋亡或壞死細胞胞膜不完整，PS外化，為Annexin V－PE+/－7AAD+亞群。

3 統(tǒng)計學處理

結 果

1 shRNA真核表達載體的構建、電泳鑒定及測序

經(jīng)BLAST檢索，證實設計好的DNA片段序列僅與PERK基因有同源性，且有明顯的特異性，陰性對照DNA片段與人任何基因無同源性，可用于shRNA的構建。

重組表達質(zhì)粒經(jīng)Sac I單酶切得到一條約916 bp的DNA小帶，初步表明4個重組質(zhì)粒均構建成功，見圖1。隨后測序結果顯示，僅PERK2－shRNA的loop環(huán)上有3個堿基與初始設計不符，但依據(jù)siRNA的設計原則，不會影響干擾實驗，其余3個重組質(zhì)粒中的目的序列與設計的寡核苷酸序列完全一致，證實重組質(zhì)粒構建成功，見圖2。

Figure 1.Digestion and identification of recombinant plasmids.1:PERK1－shRNA;2:PERK2－shRNA;3:PERK3－shRNA;4:HK －shRNA;5:marker.圖1 重組質(zhì)粒的酶切鑒定

Figure 2.The sequences of recombinant plasmids.A:PERK1－shRNA;B:PERK2－shRNA;C:PERK3－shRNA;D:HK－shRNA.圖2 重組質(zhì)粒測序結果

2 shRNA真核表達載體轉(zhuǎn)染L02肝細胞后EGFP的表達

構建的重組表達質(zhì)粒攜帶有EGFP(顯示綠色熒光)報告基因，經(jīng)Poly JetTM轉(zhuǎn)染細胞24、48 h后，熒光顯微鏡下可見轉(zhuǎn)染各質(zhì)粒的細胞帶綠色熒光，未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細胞則未出現(xiàn)熒光，見圖3。

Figure 3.Expression of EGFP in L02 cells after transfected with recombinant plasmids for 24 h(×200).A:PERK1－shRNA;B:PERK2－shRNA;C:PERK3－shRNA;D:HK－shRNA.圖3 轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒24 h后L02細胞中EGFP的表達

3 RT－PCR檢測shRNA對各組細胞內(nèi)PERK mRNA表達

不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞24 h后，提取各組細胞總RNA，RT－PCR檢測結果表明各組樣本均可見亮度均一的β－actin對照條帶，應用Quantity One軟件進行半定量分析，空白對照組、陰性對照組、各實驗組(PERK1、PERK2、PERK3)mRNA相對表達量(PERK/β－actin)分別為0.24±0.01、0.23±0.03、0.10±0.07、0.17±0.05、0.21±0.02，陰性對照組與空白對照組比較差異無顯著(P＞0.05)，各實驗組與空白對照組比較差異均顯著(P＜0.05)，并且以PERK1－shRNA的差異最為顯著，見圖4。

Figure 4.RT－PCR analysis of PERK mRNA in L02 cells.1:marker;2:control;3:HK－shRNA;4:PERK1－shRNA;5:PERK2－shRNA;6:PERK3－shRNA.圖4 RT－PCR法檢測shRNA對L02細胞中PERK mRNA表達的影響

4 Western blotting檢測shRNA對各組細胞內(nèi)PERK蛋白表達的影響

不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞24 h后，提取各組細胞總蛋白，Western blotting檢測結果顯示，空白對照組、陰性對照組、各實驗組的蛋白相對含量(PERK/β－actin)分別為 0.29±0.07、0.30±0.02、0.17±0.03、0.22±0.01、0.26±0.04，陰性對照組與空白對照組比較差異無顯著(P＞0.05)，各實驗組與空白對照組比較差異均顯著(P＜0.05)，但是 PERK1－shRNA對PERK蛋白表達的抑制作用最明顯，結合RT－PCR結果，我們將在后續(xù)實驗中選用重組質(zhì)粒PERK1－shRNA進行干擾實驗，見圖5。

Figure 5.Western blotting analysis of PERK protein in L02 cells.1:control;2:HK－shRNA;3:PERK1－shRNA;4:PERK2－shRNA;5:PERK3－shRNA.圖5 Western blotting法檢測shRNA對L02細胞中PERK蛋白表達的影響

5 PERK1－shRNA對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激狀態(tài)下L02細胞活力的影響

經(jīng)100 nmol/L毒胡蘿卜素誘導各組L02細胞24 h后，MTT測定結果表明，在ERS狀態(tài)下，與正常細胞組相比，肝細胞活力明顯降低(P＜0.05)，轉(zhuǎn)染PERK1－shRNA能明顯增加肝細胞的活力，且差異顯著(P＜0.05)，見圖6。

Figure 6.The cell viability of each group.The figure showed that endoplasmic reticulum stress induced by thapsigargin(TG)could decrease the cell viability，while such effect was inhibited by PERK1－shRNA transfection..n=3.*P＜0.05 vs normal group;#P＜0.05 vs TG group.圖6 MTT法檢測PERK－shRNA對ERS狀態(tài)下L02細胞活力的影響

6 PERK1－shRNA對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激狀態(tài)下L02細胞凋亡的影響

Annexin V－PE/7－AAD流式細胞術測定結果證實，ERS能夠誘導肝細胞凋亡(P＜0.05)，而沉默PERK基因能夠有效的抑制ERS誘導的肝細胞凋亡(P ＜0.05)，見圖7。

Figure 7.The apoptotic rate of each group.Representative graphs were obtained by flow cytometry analytic after double staining with Annexin V－PE and 7－AAD.The figure showed that endoplasmic reticulum stress could increase the apoptotic rate of L02 cells，while such effect was attenuated by PERK1－shRNA transfection..n=3.*P＜0.05 vs normal group;▲P＜0.05 vs TG group.圖7 流式細胞術檢測PERK－shRNA對ERS狀態(tài)下L02細胞凋亡的影響

討 論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)是真核細胞內(nèi)重要的亞細胞器，含多種酶系統(tǒng)，參與脂類代謝過程。多種生理或病理條件會引起未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白在ER聚集，損傷ER的正常生理功能，稱為ERS［5］。許多文獻報道ERS與酒精性肝病、糖尿病、神經(jīng)元變形等疾病有關［6］。PERK是位于ER膜上的3種跨膜蛋白之一，配體結合域位于ER腔面，效應域位于ER胞質(zhì)面，在ERS早期，PERK信號通路通過抑制蛋白質(zhì)的合成對細胞起保護作用、促進細胞生存，隨著ERS時間的延長，PERK通過誘導促凋亡因子CHOP的表達而促進細胞凋亡［1］。越來越多的研究證實肝細胞凋亡是造成肝臟損傷和肝臟疾病最基本的中心環(huán)節(jié)［7］。因此，本研究選擇構建了靶向PERK基因的shRNA表達載體，轉(zhuǎn)染L02細胞，觀察PERK基因的缺失對ERS條件下肝細胞凋亡的影響。

RNA干擾(RNA interference，RNAi)現(xiàn)象是由與靶基因序列同源的雙鏈 RNA(double－stranded RNA，dsRNA)引發(fā)的廣泛存在于生物體中的序列特異性基因轉(zhuǎn)錄后的沉默過程。細胞中特異性核酸酶Dicer將dsRNA裂解成由21－25個核苷酸組成的小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)，隨后 siRNA通過識別與之序列互補配對的mRNA使特定基因在轉(zhuǎn)錄后水平被降解從而下調(diào)靶基因表達［8－10］。2001年，Elbashir等［11］首次發(fā)現(xiàn)了哺乳動物細胞也存在RNAi現(xiàn)象。這一發(fā)現(xiàn)極大地推動了RNAi技術在疾病治療領域的研究和應用，同時也為RNAi技術廣泛應用于基因功能、信號轉(zhuǎn)導、抗腫瘤等的研究奠定了基礎。

本實驗選用武漢晶賽生物技術公司的pGenesil－1.1質(zhì)粒載體，該載體含有人RNA聚合酶Ⅲ家族的hU6啟動子，RNA聚合酶Ⅲ識別的終止信號3'端6個連續(xù)的T，可指導轉(zhuǎn)錄出3'端突出包含莖環(huán)的發(fā)卡結構，同時該載體含有報告基因EGFP和抗生素標記，可分別用于轉(zhuǎn)染效率的觀察以及抗生素篩選陽性克隆。此外，載體多克隆的酶切位點中有一個Sac I酶切位點，我們在插入的DNA片段中也設計了Sac I位點，當片段插入正確時，質(zhì)粒就能被Sac I酶切出一條約916 bp的DNA小帶。經(jīng)酶切鑒定分析，構建的重組質(zhì)粒酶切片段與預期大小一致。測序分析，3個重組質(zhì)粒測序結果與初始設計完全一致，僅有1個重組質(zhì)粒的loop環(huán)上有3個堿基與初始設計不符，但不會影響干擾實驗，說明4個重組質(zhì)粒構建有效。

將shRNA表達載體導入細胞中是誘導RNAi發(fā)生的關鍵。我們將4個shRNA表達載體經(jīng)Poly JetTM轉(zhuǎn)染試劑包裹轉(zhuǎn)染L02細胞，與未轉(zhuǎn)染組相比，各組均有熒光的表達，表明我們成功將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入細胞中。RT－PCR和Western blotting結果均顯示PERK1 shRNA組PERK表達量最低，表明在蛋白和mRNA水平上PERK1 shRNA對目標基因表達有最明顯抑制效果。該結果也為下一步進行L02細胞中PERK基因的功能研究奠定了有利的實驗基礎。

Saito等［12］在成骨細胞的研究中發(fā)現(xiàn)，ERS反應介導的PERK－eIF2α－ATF4通路參與細胞的分化過程。研究［2，3］發(fā)現(xiàn) PERK/ATF4/CHOP 通路在 ERS誘導的鼠INS－1和MIN6細胞凋亡中發(fā)揮了重要作用。許多肝臟疾病的發(fā)病機制與肝細胞凋亡密切相關。然而，PERK相關的信號通路是否參與了肝細胞的凋亡至今尚不清楚。本研究中流式細胞術結果表明，沉默了PERK基因的肝細胞ERS組較ERS組細胞凋亡率明顯降低，提示PERK基因沉默對ERS狀態(tài)下肝細胞凋亡有抑制作用，但具體機制還有待進一步研究。在后續(xù)實驗中，我們將進一步應用該表達載體深入研究PERK基因及其相關的信號通路在ERS誘導的肝細胞凋亡過程中的作用。

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