蘋果桉組織培養技術探討

劉 輝，陳家龍，李 宇，葉朝軍，朱祝軍

(1.浙江大學 農業與生物技術學院，浙江 杭州 310029;2.溫州科技職業學院，浙江 溫州 325006)

桉樹是桃金娘科(Myrtacae)桉樹屬(Eucalyptus)、杯果木屬(Angophora)和傘房屬(Corymbia)的眾多樹種的統稱，包括808個種和137個亞種或變種。桉樹具有生長快、材質好、輪伐期短、萌生能力強、適應性佳等特點，是世界上發展最快的短輪伐期工業原料林樹種，目前已有100多個國家和地區進行了引種栽培。

除作為工業生產原料外，桉樹還具有較高的觀賞價值。觀賞桉樹是指樹干、樹冠、枝葉、花、果等部位形態優美獨特，色彩艷麗。具有觀賞價值的桉樹，主要來自桉樹屬和傘房屬，包含了100余種桉樹。在澳大利亞等國家，觀賞類桉樹已廣泛應用于庭院栽培、道路綠化等。桉樹作為觀賞植物具有管理容易、成本低廉、易于修剪和抗病蟲害能力強等優點。隨著社會經濟的發展，國內開始重視觀賞桉扦插繁殖及組織培養快速繁育。桉樹是異花授粉植物，有性繁殖容易導致變異，難以保持物種的優良性狀;用扦插方式進行繁殖，其繁殖速度無法滿足生產的需要;采用組培快繁可使桉樹保持其遺傳穩定性，繁殖系數大，可滿足生產需要，因而具有重要的意義。

自20世紀70年代末以來，澳大利亞、巴西、日本等國家已成功建立起一些桉樹種類的組織培養快繁體系，并用于工廠化育苗，對優良品種的推廣產生了積極的作用。但觀賞桉樹種類繁多，對于蘋果桉的組培快繁技術研究在國內還未見報道。

作者以蘋果桉(Eucalyptus bridgesiana)為材料，研究其外植體滅菌方法，探討不同培養基和激素組合對蘋果桉腋芽誘導萌發、增殖及生根效率的影響，為建立蘋果桉組織培養快繁的技術體系提供提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2009年進行。供試材料為蘋果桉，由武漢香草花卉有限公司提供，組織培養外植體是播種后1年生盆栽植株枝條。

1.2 方法

滅菌。以蘋果桉樹盆栽苗木上的半木質化枝條莖段做外植體。除去葉片和蟲病斑，用自來水流水沖洗30 min。然后在超凈工作臺上用75%的乙醇消毒處理10 s，選用0.1%HgCl2溶液分別滅菌5，10，15 min，無菌水沖洗6次后將材料切成帶頂芽或腋芽的長1.0 cm莖段接種到誘導培養基，10 d后統計污染率和褐化率。

培養基配方及激素處理。誘導培養基采用MS基本培養基和 WPM，并添加細胞分裂素6-BA(0.5 mg·L－1)和生長素 NAA(0.1 mg·L－1)的激素組合。增殖培養基為 MS基本培養基，添加6-BA和 NAA，6-BA濃度設 3個處理，即 0.5、1.0、1.5 mg·L－1，NAA 濃度為 0.1 mg·L－1。生根培養基:MS培養基添加不同濃度的NAA，濃度設置為0.5、1.0和1.5 mg·L－13個處理。

外植體培養方法。不定芽的誘導，將滅菌的莖段切成1.0 cm左右的帶腋芽莖段，接種于誘導培養基上，每瓶接種2個外植體，重復15次，15 d后統計腋芽萌發效率;增殖培養，將誘導的腋芽新梢切下，轉接到增殖培養基上，培養28 d后統計誘導出芽率;生根培養:選擇長勢較壯、高約2.0 cm的芽轉接到生根培養基，培養28 d后統計誘導生根率。

培養條件。組織培養室的環境條件控制在溫度為(25±2)℃，空氣相對濕度70%左右，光周期為 12h/12h(白天/黑夜)，光照強度約為100 μmol·m－2·s－1。

2 結果與分析

2.1 不同滅菌時間對蘋果桉莖段組培污染率的影響

由表1可知，用0.1%HgCl2溶液滅菌5 min的外植體在培養基上全部污染，隨著滅菌時間的延長，污染率逐漸降低，但當滅菌時間達到15 min時，接種莖段容易發生褐化，褐化率達到40%。因此合適的滅菌時間應為10 min。

表1 0.1%HgCl2溶液滅菌時間對蘋果桉莖段污染率的影響

2.2 不同基本培養基對莖段腋芽萌發誘導的影響

采用0.1%HgCl2溶液對蘋果桉滅菌10 min后，無菌水沖洗6次。將材料切成帶頂芽或腋芽長1.0 cm的莖段接種到誘導培養基，15 d后統計萌發率。結果表明，2種基本培養基 MS和WPM萌發率分別為40%和33%，MS培養基略好于WPM培養基(表2)。

表2 不同基本培養基對蘋果桉莖段腋芽萌發誘導影響

2.3 不同6-BA濃度對無菌苗增殖的影響

將誘導的蘋果桉腋芽新梢切下，轉接到增殖培養基上，研究不同6-BA濃度對無菌苗增殖的影響。由表3可知，蘋果桉樹的無菌苗隨著細胞分裂素濃度的增加，增殖系數呈上升趨勢，6-BA濃度為0.5 mg·L－1時，增殖系數僅為1.4，濃度增加到1.0 mg·L－1時，增殖系數增加到2.1，但當濃度達到1.5 mg·L－1時部分小苗出現玻璃化現象。

表3 不同6-BA濃度對蘋果桉無菌苗增殖的影響

2.4 不同濃度NAA對無菌苗生根的影響

如表4所示，當NAA濃度為0.5 mg·L－1時，生根率僅為33.3%，當濃度提高到1.0 mg·L－1時，生根率增加到80%，當 NAA為1.5 mg·L－1時生根率為56.7%，但基部形成大量的愈傷組織。

表4 不同NAA濃度對蘋果桉無菌苗生根率的影響

3 小結和討論

外植體莖段的年齡和生理狀態是影響組織培養再生的重要因素。郭洪英等研究了不同年齡和不同木質化程度的桉樹莖段根系發育情況，表明木質化程度較輕的幼嫩莖段具備較強的分裂和分化能力，衰老的莖段由于含有生根抑制物質，易發生根系發育不良的狀況［1］。而徐南翔等人的研究則表明若芽組織過于幼嫩，在消毒過程中易受殺傷且褐化嚴重，因而不宜采用［2］。在本研究中采用了木質化中等的莖段組織，取得了較好的效果。

不同的基本培養基對于腋芽萌發誘導效果不同。宋建英等發現MS培養基對鄧恩桉的誘導效果最好［3］，而郭洪英的研究表明采用1/2 H培養基并添加適量的活性炭誘導效果最佳［1］，這可能是由于不同的桉樹品種需求不同所造成的。在本研究中采用的MS和WPM培養基效果基本相同，MS培養基萌發率略高，因此在后續試驗中采用了MS基本培養基。

桉屬樹種的莖段必須通過外界物理或化學因素的刺激才能產生誘導根原基。根原基由皮部直接形成，或先形成愈傷組織后再產生根原基［4］，直接形成根原基具有生根時間短、根莖結合度高的優勢。由愈傷組織分化形成的根，吸收水分能力差，成活率較低［5］。因此在莖段組織再生的過程中避免莖段愈傷組織的發生、促進皮部直接生根是桉樹生根研究的關鍵。在本研究中我們分別采用6-BA和NAA用于腋芽的增殖和根系的誘導。采用1.0 mg·L－1的 NAA，生根率達到80%，同時也能避免愈傷組織的形成。這與我們此前在圓葉桉中的研究類似［6］。

桉樹組織培養體系的建立涉及到的因素較多，如莖段的篩選、基本培養基的選擇、激素配比的優化等，還需進一步研究優化方案，提高效率。

［1］郭洪英，陳炙，楊曉蓉，等．影響桉樹組培苗根系發育關鍵因子的研究［J］．四川林業科技，2008，29(1):20－26.

［2］徐南翔．桉樹組織培養育苗技術的研究［J］．吉林農業，2010(11):47－48.

［3］宋建英．鄧恩桉的組織培養和植株再生［J］．林業科學，2010，46(6):138－145.

［4］朱鵬，徐建民．桉樹扦插繁殖生根內在因素影響研究綜述［J］．廣西林業科學，2007，36(2):71－74.

［5］王蒂．植物組織培養［M］．北京:中國農業出版社，2004:164－168.

［6］陳家 龍，劉 輝，余 宏 傲，等．圓 葉 桉(Eucalyptus pulverulenta Sims)繁殖技術初探［J］．浙江農業科學，2009(3):692－694.