依達拉奉對帕金森病小鼠黑質GSK-3 β表達的影響

周 波 文 敏 王文靜 何宇紅 余 彥 臧貴勇 焦 玲 張春林(貴陽醫學院人體解剖學教研室,貴州 貴陽 550004)

目前尚缺乏帕金森病(PD)的特異性治療方法,多年來一直以左旋多巴替代治療為主,但遠期療效差,出現癥狀波動、異動癥以及精神癥狀等并發癥,不能延緩病程的發展和減少死亡率。因此發展長期有效的治療方法,延緩病情進展,提高PD患者生活質量是目前亟待解決的問題。依達拉奉是一種廣泛運用于缺血性腦卒中患者的氧自由基清除劑〔1〕,它可以通過抑制脂質過氧化〔2〕和調控凋亡相關基因的表達〔3〕抑制細胞死亡,發揮神經保護作用。本實驗采用百草枯聯合代森錳建立PD小鼠模型,通過檢測黑質TH陽性神經元及糖原合成酶-3β(GSK-3β)的表達,探討依達拉奉對PD的治療作用。

1 材料與方法

1.1 模型建立 健康雄性C57BL/6小鼠30只,7周齡,體重24～26 g,由重慶騰鑫比爾實驗動物銷售有限公司提供。小鼠飼養于貴陽醫學院動物實驗中心,室溫維持在(18±2)℃,濕度維持在(50±10)%,12/12光暗周期,自由進食和飲水。實驗開始前先給予適應環境1 w。小鼠隨機分為正常對照組(10只)、模型組(10只)和依達拉奉治療組。模型組給予百草枯(10 mg/kg,Sigma公司)和代森錳(30 mg/kg,Sigma公司),溶于生理鹽水后腹腔注射,每周二、四早上各一次,連續6 w;依達拉奉治療組在成功建模后給予依達拉奉注射液(商品名:必存,3 mg/kg,先聲藥業提供)腹腔注射,1次/d,連續2 w;對照組給予同等劑量的生理鹽水。

1.2 敞箱實驗 敞箱實驗用于檢測小鼠的自主運動活性。自制敞箱,長 ×寬 ×高為 80 cm ×80 cm ×40 cm,底部刻出16 cm×16 cm的格子25個。內壁涂黑。在安靜、光線較暗的環境中檢測。小鼠適應環境10 min后計數3 min內小鼠水平運動(移動的格子數)和垂直運動(雙前肢離開地面站立的次數)。水平運動計分:動物穿過1格(三爪以上跨入)為1分,如果沿直線走每10 cm為1分;垂直運動計分:動物雙足離開地面為標志,無論站立多長時間直至放下雙足為1分。

1.3 標本采集 用3.6%的水合氯醛(1 ml/100 g體重)麻醉動物,在其左胸前壁縱行剪開心包,充分暴露心臟,經心包橫竇引過一絲線,繞主動脈及肺動脈根部打一松結,剪開左心室,將套管插入升主動脈中,結扎固定套管并立即開始灌注。先用生理鹽水50 ml(37℃)沖去血液,流速宜大,至右心室流出液體無色或略帶紅色,即可終止灌洗而改用固定液(4%多聚甲醛、飽和苦味酸、戊二醛)灌注,時間約30 min。灌注后開顱取腦,放入4%多聚甲醛固定24 h。經脫水、常規石蠟包埋、冠狀連續切片,切片厚6 μ m,隔6取2,用于免疫組織化學染色。

1.4 TH和GSK-3β免疫組化(SABC法) ①石蠟切片常規脫蠟至水;②經新鮮配制3%H2O210 min滅活內源性酶;③用0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液進行熱抗原修復;④滴加正常山羊血清封閉液,室溫20 min。甩去多余液體,不洗;⑤滴加一抗濕盒中4℃過夜;⑥滴加生物素化山羊抗兔IgG,濕盒中37℃20 min;⑦滴加試劑SABC,濕盒中37℃20 min;⑧DAB顯色,鏡下控制反應時間;⑨脫水、透明和封片,顯微鏡下觀察。各組切片均在相同時間、相同條件下完成免疫組織化學顯色。對照組切片用0.1 mol/L PBS取代一抗,其余步驟同實驗組。結果判定:以胞質中出現棕黃色顆粒為陽性神經元。

1.5 圖像分析 每只小鼠隨機選取5張切片,每張切片隨機選取4個視野,在同一視場面積,同一放大倍數,同一背景光強度下采集圖像,運用美國Mc公司Image-Pro Plus 6.0軟件統計TH陽性神經元數量以及測定GSK-3β陽性反應物積分光密度。

2 結 果

2.1 敞箱實驗 敞箱實驗檢測顯示,模型組小鼠水平運動、垂直運動活性較正常對照組顯著降低(P＜0.05);依達拉奉治療后,運動活性較模型組有了顯著改善(P＜0.05),但與正常對照組間仍存在顯著差異(P＜0.05),見表1。

表1 各組小鼠水平運動、垂直運動比較(±s,n=10)

表1 各組小鼠水平運動、垂直運動比較(±s,n=10)

組別 水平運動 垂直運動正常對照組 120.33±5.85 18.667±3.08模型組 70.833±8.47 9.16±1.17依達拉奉治療組 100.4±20.24 12.2±0.84

2.2 TH免疫組織化學染色 TH免疫組織化學染色結果顯示(圖1):正常對照組小鼠在中腦腹側黑質致密部和腹側被蓋區可見許多TH陽性神經元(107.83±7.885),細胞多為錐體形和三角形,胞漿內棕色顆粒濃;模型組小鼠黑質致密部和腹側被蓋區TH陽性細胞顯著減少(36.17±4.082),較正常組減少約66.5%,胞漿內染色極為淺淡。依達拉奉治療后TH陽性細胞有了顯著回升,但數量上仍比正常對照組少(84.67±4.082),且染色也較正常對照組淺淡。

圖1 各組小鼠黑質TH免疫組織化學染色(SABC法,×100)

2.3 GSK-3β免疫組織化學染色 GSK-3β免疫組織化學染色結果顯示(圖2):正常對照組小鼠黑質神經元胞漿呈淡棕色,GSK-3β積分光密度值較低(0.195 14±0.006 98),蛋白表達水平較低;模型組大量胞漿呈深棕色,GSK-3β積分光密度值顯著升高(0.284 92±0.008 60),蛋白高表達。依達拉奉治療后GSK-3β蛋白表達顯著降低(0.243 39±0.004 91)。

圖2 各組小鼠黑質GSK-3β免疫組織化學染色(SABC法,×400)

3 討 論

近年來由于除草劑等環境毒素在鄉村的大量使用,鄉村PD的發病率呈現上升趨勢。環境毒素在PD中的作用日益受到關注。百草枯是世界上最為常用的除草劑之一,由于其化學結構與MPTP的活性物質MPP+(一種非自然產生的神經毒素,能夠引起人類及動物產生帕金森病)極為相似,自2007年起已經被美國等13個國家禁用或限用,但在我國仍廣泛使用〔4〕。代森錳是一種除真菌劑,與百草枯的使用存在地域上的重疊,能夠加劇多巴胺神經元的丟失和運動障礙〔5〕。因此,聯合百草枯與代森錳建立小鼠PD模型,既符合我國國情,又符合PD多環境因素致病的學說。

GSK-3β是一種多功能的絲氨酸/酪氨酸酶,廣泛分布于哺乳動物腦組織,涉及wnt、PI3K/AKT,G蛋白復合受體等信號傳導通路,通過磷酸化代謝酶、信號蛋白、結構蛋白和轉錄因子,參與細胞命運的調控,與PD等神經退行性疾病的發生密切相關〔6〕。GSK-3β現已被作為糖尿病、阿爾茨海默病等多種疾病的治療靶標〔7〕。Takashima 等〔8〕在阿爾茨海默病、FTDP-17 等神經退行性疾病的研究中發現,激活GSK-3β導致神經纖維纏結形成和神經元丟失;抑制GSK-3β將抑制神經纖維纏結形成和神經元丟失?；谏鲜鲅芯?GSK-3β抑制劑成為了當前AD和其他神經退行性病藥物治療的發展方向。本實驗研究結果顯示,依達拉奉能夠顯著改善百草枯聯合代森錳引起的小鼠運動能力減退,黑質多巴胺神經元數量減少和GSK-3β表達增高?？梢?依達拉奉對PD有較好的治療作用,其機制可能是通過抑制GSK-3β的表達,進而抑制黑質神經元凋亡,這與 Wu等〔9〕通過促紅細胞生成素(EPO)抑制GSK-3β活性,降低 caspase-3表達,從而保護PC12細胞免受MPP+引起的細胞凋亡相一致。雖然依達拉奉可能成為PD治療比較有希望的選擇,但仍然有很多關鍵的問題還不清楚,如治療的最佳時機和劑量等,還有待于進一步的研究。

1 Shichinohe H,Kuroda S,Yasuda H,et al.Neuroprotective effects of the free radical scavenger Edaravone(MCI-186)in mice permanent focal brain ischemia〔J〕.Brain Res,2004;1029(2):200-6.

2 Bates B,Hirt L,Thomas SS,et al.Neurotrophin-3 promotes cell death induced in cerebral ischemia,oxygen-glucose deprivation,and oxidative stress:possible involvement of oxygen free radicals〔J〕.Neurobiol Dis,2002;9(1):24-37.

3 Chen JX,Zhao T,Huang DX.Protective effects of edaravone against cobalt chloride-induced apoptosis in PC12 cells〔J〕.Neurosci Bull,2009;25(2):67-74.

4 Cicchetti F,Drouin-Ouellet J,Gross RE.Environmental toxins and Parkinson′s disease:what have we learned from pesticide-induced animal models〔J〕？Trends Pharmacol Sci,2009;30(9):475-83.

5 Fei Q,Ethell DW.Maneb potentiates paraquat neurotoxicity by inducing key Bcl-2 family members〔J〕.J Neurochem,2008;105(6):2091-7.

6 Takashima A.Drug development targeting the glycogen synthase kinase-3beta(GSK-3beta)-mediated signal transduction pathway:role of GSK-3beta in adult brain〔J〕.J Pharmacol Sci,2009;109(2):174-8.

7 Ojo KK,Gillespie JR,Riechers AJ,et al.Glycogen synthase kinase 3 is a potential drug target for African trypanosomiasis therapy 〔J〕.Antimicrob Agents Chemother,2008;52(10):3710-7.

8 Takashima A.GSK-3 is essential in the pathogenesis of Alzheimer′s disease〔J〕.J Alzheimers Dis,2006;9(3):309-17.

9 Wu Y,Shang Y,Sun S,et al.Erythropoietin prevents PC12 cells from 1-methyl-4-phenylpyridinium ion-induced apoptosis via the Akt/GSK-3beta/caspase-3 mediated signaling pathway〔J〕.Apoptosis,2007;12(8):1365-75.