復元膠囊對氣虛血瘀證模型大鼠血栓前狀態的影響

徐 丹 李榮亨 李學榮 (重慶醫科大學附屬第一醫院中西醫結合科,重慶 400016)

氣虛血瘀證是諸多老年病的常見證候,尤其在心、腦血管疾病中更為常見,中醫學認為 “氣為血之帥,氣能行血”,若氣虛鼓動無力,循經之血緩慢滯澀瘀積于經脈中形成血瘀。目前普遍認為中藥益氣、活血方制劑能有效改善老年病中氣虛血瘀證癥狀。復元膠囊在益氣、活血中藥的基礎上加用補腎中藥,前期研究表明〔1,2〕,復元膠囊具有調節血管平滑肌細胞 (VSMC)收縮與舒張平衡及調節VSMC分泌多種血管活性物質的作用。本文采用多因素復合方法制作大鼠氣虛血瘀證模型,檢測大鼠血漿血管性血友病因子 (vWF)、組織型纖溶酶原激活物 (t-PA)、纖溶酶原激活物抑制物 (PAI)的含量,探討益氣活血補腎復方復元膠囊對氣虛血瘀證大鼠血栓前狀態的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 體重500～600 g的16月齡的SD大鼠60只,雌雄各半,由重慶醫科大學動物中心提供,合格證號:SCXK(渝)2010-0001。

1.1.2 實驗藥物 復元膠囊由生曬參、黃芪、丹參、鹿茸、淫羊藿、川芎、枸杞等組成,具有益氣活血補腎的功效,重慶希爾安藥廠生產。每粒膠囊重0.41 g,相當于生藥3 g。芪參膠囊由黃芪、丹參、人參、三七、水蛭等組成,具有益氣活血的功效,河南省新誼藥業股份有限公司生產,批號:Z20064445,每粒膠囊重750 mg。

1.1.3 主要儀器 全自動血液流變測定儀(重慶醫科大學附一院中西醫結合科提供)、移液槍、離心機、水浴箱、冰箱、試管、酒精燈、真空抗凝采血管、酶標儀都由重慶醫科大學眼科實驗室提供。

1.1.4 主要試劑 雙蒸水由實驗室提供,大鼠組織型纖溶酶原激活物(TPA)ELISA試劑盒、大鼠纖溶酶原激活物抑制因子(PAI)ELISA試劑盒、大鼠血管性血友病因子/瑞斯托霉素輔因子(vWF)ELISA試劑盒,由上海源葉生物科技有限公司提供,批號:20101227。

1.2 方法

1.2.1 造模 60只SD大鼠在實驗室喂養1 w,適應環境。1 w后隨機抽取10只大鼠為空白組,余下50只大鼠每日攝正常食量的2/3,并加入高脂飼料(每5 kg普通飼料加豬油1 kg),在每日控制食量的基礎上將大鼠放入涼水(10～14℃)中游泳,直至疲勞,將其打撈出水面,撈出后不予保溫及擦拭水跡,使之暴露于空氣中自然晾干。每日一次,連續4 w,建立氣虛血瘀證模型〔3,4〕,即出現精神萎靡,倦怠嗜睡,攻擊性減退,毛發枯黃無潤澤,輕度稀便,尾尖出現輕度瘀斑血點。隨機取10只模型大鼠和空白組10只大鼠,抽尾靜脈,測定血液流變學,表明造模成功。見表1。

表1 造模組與空白組血液流變學的變化(±s,n=10)

表1 造模組與空白組血液流變學的變化(±s,n=10)

與空白對照組比較:1)P＜0.05

組別 高切(mps)200/s中切(mps)30/s低切(mps)3/s紅細胞聚集指數(Arbc)電泳時間(s)空白組4.81±0.22 6.00±0.28 9.23±0.56 7.94 ±0.57 17.51±1.17模型組 9.03 ±0.091)11.64 ±0.531)16.61 ±0.29 1)11.09 ±0.381)29.99 ±0.191)

1.2.2 分組 造模成功后將50只SD大鼠隨機分為模型組,芪參膠囊組,復元低劑量組,復元中劑量組,復元高劑量組。

1.2.3 給藥 造模成功后根據 Meeh-Rubner氏公式〔5〕計算給藥劑量,計算出大鼠每日應服復元膠囊(447.49 mg·kg-1·d-1),芪參膠囊(515.7 mg·kg-1·d-1)。按照復元膠囊大、中、小劑量組以 4∶2∶1的給藥標準,灌胃,給藥容量為13.3 ml/kg,模型組和空白組給予等量生理鹽水,每天1次,連續4 w。芪參膠囊組的給藥劑量為520 mg/kg,每天一次,連續給藥4 w。動物分組及給藥方法,見表2。

表2 動物分組以及飼養方法

1.2.4 觀察指標

1.2.4.1 一般情況 觀察大鼠的精神狀況,對抗及攻擊力,毛發,大便,尾部瘀斑輕重,游泳及耐疲勞時間。

1.2.4.2 血液黏度測定 用真空抗凝管取下腔靜脈血3 ml,采用全自動血液流變測定儀,檢測全血黏度、紅細胞聚集指數、紅細胞電泳時間。

1.2.4.3 vWF、PAI-1和t-PA測定 給藥4 w后取標本:將大鼠用10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉后仰臥固定于手術臺上,于胸骨柄上一橫指、正中線向右旁開1 cm處做切口,于觸及動脈搏動處分離肌肉可見右側頸動脈,以5號頭皮針穿刺血管取血,放于含有1/10容積的0.109 mol/L枸櫞酸鈉抗凝試管中,經3 000 r/min離心10 min后,收集上清液(血漿,黃色),放置于-20℃低溫冰箱中保存測定。采用酶聯免疫吸附法測定 vWF,采用ELISA測定PAI-1和 t-PA,均嚴格按照試劑說明書進行操作,根據所繪標準曲線計算各待測標本含量。

1.3 統計學分析 統計學分析采用SPSS.17.0統計學分析軟件進行處理,計量資料結果全部采用±s表示,多組均數間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)和兩兩比較(LSD法)。

2 結 果

2.1 一般情況 模型組與空白組比較,精神萎靡,對抗性,攻擊性差,毛發枯黃無光澤,大便稀溏,耐疲勞時間延長,尾尖部出現不同程度的瘀血點。芪參膠囊組與模型組比較,精神有所改善,對抗性攻擊性較好,毛發枯黃稍有光澤,大便稍稀溏,尾部瘀血點改善不明顯。復元膠囊各組與模型組比較,精神好,對抗性攻擊性強,毛發潤澤,大便成形,耐疲勞時間與空白組相當,尾部瘀斑明顯減退。

2.2 WF、PAI-1和t-PA含量 模型組與空白組比較,vWF、PAI-1含量明顯升高,t-PA明顯下降(P＜0.05)。復元膠囊各組、芪參膠囊組與模型組比較,vWF、PAI-1含量明顯下降,t-PA明顯升高(P＜0.05),其中復元膠囊中劑量組作用效果最為明顯,且復元膠囊各組vWF、PAI-1含量低于芪參膠囊組(P＜0.05),而復元膠囊各組 t-PA高于芪參膠囊組(P＜0.05)。見 表3。

表3 各組大鼠t-PA、PAI、vWF比較(±s)

表3 各組大鼠t-PA、PAI、vWF比較(±s)

與模型組比較:1)P＜0.01;與芪參膠囊組比較:2)P＜0.01

組別 n t-PA(IU/ml) PAI(IU/ml) vWF(IU/ml)空白組 10 0.998 ±0.0761) 0.346±0.0361) 0.346±0.0361)模型組 9 0.277±0.054 0.974±0.032 0.974±0.032芪參膠囊組 9 0.465±0.0511) 0.762±0.0251) 0.762±0.0251)復元膠囊低劑量組 10 0.668±0.0631)2) 0.612±0.038 1)2) 0.612±0.0381)2)復元膠囊中劑量組 9 0.971±0.0381)2) 0.347±0.031 1)2) 0.347±0.0311)2)復元膠囊高劑量組 9 0.681±0.0631)2) 0.632±0.017 1)2) 0.632±0.2251)2)

3 討 論

本實驗采用饑餓、勞累、高脂等多因素復合作用來建立氣虛血瘀證模型。根據中醫氣血關系理論,氣為血帥,氣能推動血液運行,氣虛則氣不行血,氣不攝血,導致血瘀;根據中醫病因病機方面考慮,氣虛血瘀證病機是氣虛為本在先,血瘀為標產生于后,故造模重點應放在血瘀之根本原因-氣虛的致病因素上。本實驗采用上述多因素復合方法成功制作了氣虛血瘀證模型,大鼠出現了不同程度的氣虛、血瘀相關癥狀表現,體重減輕,血液流變學異常,復合大鼠氣虛血瘀證模型。

血栓前狀態是指各種原因引起的血管內皮細胞、血小板功能、纖溶系統等有關因子發生變化或血黏滯度增加所引起的病理狀態,有利于血栓形成的病理過程。

vWF是血管內皮細胞特異性標志物之一〔6〕,vWF在微血管內皮細胞受到刺激時釋放至血漿,其水平升高可作為微血管內皮細胞受損的標志〔7〕,vWF與微血管病變的關系密切。t-PA的血液含量及活性能直接反映纖溶系統功能,可預測血栓形成的危險度〔8〕。體內同時存在著纖溶酶原激活物抑制物(PAI),通過與t-PA形成1∶1分子復合物,使t-PA失活〔9〕。t-PA與PAI是維持凝血與纖溶動態平衡的一對重要因子,兩者失衡則易導致出血或凝血。氣虛血瘀證多見于心腦血管疾病,慢性腎病,腫瘤等,上述疾病都較易容易形成血栓。

本實驗研究結果說明氣虛血瘀證大鼠不僅存在內皮細胞的結構或功能的異常,同時還處在一個血栓前狀態。祖國醫學認為,氣有推動,固攝,溫煦血液的功能,氣虛則上述功能減弱,導致血液停滯而瘀。腎為先天之本,腎氣衰則元氣亦衰。因此補腎氣是治療氣虛病證的根本。芪參膠囊(黃芪、丹參、人參、三七、水蛭等)是由益氣活血中藥組成的,復元膠囊在益氣活血中藥的基礎上加用補腎藥,如鹿茸、淫羊藿、肉蓯蓉等,具有益氣活血補腎之功效。實驗證實三七皂苷、水蛭素、黃芪、人參皂苷有調節凝血與纖溶的作用,改善 t-PA 與 PAI的失衡〔10～13〕。本實驗可見加有補腎中藥的復元膠囊能更有效的改善血栓前狀態,且沒有藥物劑量依賴性。

本研究表明了運用益氣活血法補腎比單用益氣活血法更能有效的調節氣虛血瘀證大鼠的血栓前狀態,維持t-PA/PAI之間的平衡,其作用機制可能與降低vWF因子含量,改善內皮細胞功能或結構有關。復元膠囊中補腎藥物的藥理研究中,沒有報道有直接影響凝血、纖溶因子的作用,更確切的機制有待更進一步的研究。

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