菟絲子醇提液對衰老模型大鼠肝細胞p16和cyclinD1基因表達的影響

孫 潔 李 晶 歐 芹 魏曉東 樸金花 葛堂棟 王迪迪

(佳木斯大學基礎醫學院生物化學教研室,黑龍江 佳木斯 154007)

細胞在周期時相的變遷中進入增殖、分化、衰老和死亡等生理狀態。細胞周期運轉沿著G1期、S期、G2期和M期有序進行。近年來研究表明,細胞周期調控的核心為細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)的活性表達與調控和不同周期時相之間的轉變的生物學意義,其中以G1/S、G2/M關卡的調節最為重要〔1〕,而細胞周期的完成依賴于一系列正負調節因子的相互作用順利渡過G1/S、G2/M兩個關卡的轉變。菟絲子常用作補益中藥,藥理學研究表明其具有補腎壯陽、提高機體免疫能力、調節內分泌、抗氧化等作用〔2～4〕。本實驗旨在觀察細胞調控因子p16和cyclinD1的表達,研究菟絲子醇提液的抗衰老機制。

1 材料與方法

1.1 藥品及實驗動物 選用 Wistar大鼠50只,雌雄各半,體重180～220 g。由佳木斯大學實驗動物中心提供(許可證號:SYXK黑20030014)。菟絲子購自佳木斯寶泰醫藥,由本校生藥教研室鑒定。以8倍乙醇回流提取,旋轉蒸發器回收乙醇,將菟絲子制成生藥濃度為0.15/ml的菟絲子醇提物水溶液,采用鹽酸-鎂粉實驗鑒定菟絲子醇提液中所含成分。

1.2 動物分組及處理 50只大鼠隨機分為青年組10只;衰老模型組10只;給藥組30只,又分15 d、30 d和45 d組,每組各10只,雌雄各半。各組正常飲食,衰老模型組和給藥組按48 mg/kg注射 D-gal,連續注射45 d后,衰老模型組按0.5 ml/100 g體重灌服溫開水;給藥組按0.8 g/kg體重灌服菟絲子醇提液。連續給藥后分別于灌服后第 15、30、45天處死動物,提取肝組織,液氮保存備用。

1.3 指標的測定 采用Trizol法提取肝組織RNA,核酸蛋白分析儀測定RNA濃度及純度。采用電泳凝膠成像系統觀察mRNA表達量。RT-PCR法檢測p16、cyclin D1 m RNA表達水平:cDNA反應體系:引物選擇Oligo d T18-Adaptor Primer,5×RNA PCR buffer 5 μ l,無 RNA 酶水 6.5 μ l,dNTP 混 合物 4 μ l,RNA 酶抑 制劑 0.5 μ l,AMV 逆 轉錄 酶 1 μ l,Oligo-dT 引 物 1 μ l,RNA 樣 品2 μ l,混勻,移入 PCR 儀,42℃ 60 min;95℃ 5 min;1 次循環。PCR反應:采用GAPDH和 β-actin作內參,GAPDH引物5'-CTGAATTCGGGCTCTCCAGAACATCAT C-3',5'-CAGGATCCC CAGCGTCAAAGGTGGA-3'(擴增產物 300 bp);β-actin引物5'-CTACAATGAGCTG CGCGTGGC-3′,5'-CAGGTCCAGACGCAGGATGGC-3'(擴增產物242 bp);p16引物5'-GATGATGGGCAACGTCAAA-3',5'-AGAGTAGATACCGCAAATACCG-3'(擴增產物248 bp);cyclinD1引物5'-GGAGCAGAAGTGCGAAGA-3',5'-GGGTGGGTTGGA AAT GAA-3'(擴增產物394 bp)。94℃5 min,1循環,94℃40 s,55℃45 s,72℃45 s;35個循環,72℃7 min。PCR產物經瓊脂糖電泳分離后以凝膠成像系統掃描,測定光密度值,并計算p16/GAPDH和cyclinD1/β-actin光密度比值。采用免疫組化SABC法檢測p16和cyclinD1蛋白的表達。

1.4 統計學處理 采用SPSS12.0統計分析軟件,實驗數據用±s表示,進行方差分析,q檢驗。

2 結 果

2.1 菟絲子醇提液對衰老模型大鼠肝組織p16基因表達的影響 擴增后得到GAPDH 300 bp和p16 248 bp兩個片段,GAPDH和p16擴增條件完全一致。圖像分析結果(見表1,圖1,圖2)顯示:與青年組相比衰老模型組及各給藥組大鼠p16 m RNA及蛋白表達顯著增高(P＜0.01);與衰老模型組比較,菟絲子30 d、45 d給藥組mRNA及蛋白表達明顯降低(P＜0.01),并且兩給藥組間相比較表達無差別(P＞0.05)。

2.2 菟絲子醇提液對衰老模型大鼠肝組織cyclinD1基因表達的影響 擴增后得到 β-actin 242 bp和cyclinD1 394 bp兩個片段,β-actin和cyclinD1擴增條件完全一致。圖像分析結果(見表2,圖3,圖4)顯示:與青年組比較,模型組及各給藥組 cyclinD1 mRNA及蛋白表達顯著降低(P＜0.05);與模型組比較,菟絲子15 d、30 d、45 d給藥組 cyclin D1 mRNA及蛋白表達明顯升高(P＜0.05),并且各給藥組間相比較表達有差別(P＜0.05)。

表1 菟絲子醇提液對衰老模型大鼠肝組織p16基因表達的影響( ±s,n=10)

表1 菟絲子醇提液對衰老模型大鼠肝組織p16基因表達的影響( ±s,n=10)

與青年組比較:1)P＜0.01;與模型組比較:2)P＜0.01;給藥30 d、45 d組間比較:3)P＜0.05;下表同

組別 p16/GAPDH 陽性細胞數(%)青年對照組 0.82±0.05 8.62±4.69衰老模型組 1.32±0.09 1) 53.70±6.951)給藥15 d組 1.25±0.06 1) 48.13±5.151)給藥30 d組 1.06±0.071)2) 36.23±4.911)2)給藥45 d組 1.04±0.101)2) 32.17±7.871)2)

表2 菟絲子醇提液對衰老模型大鼠肝組織cyclinD1基因表達的影響(±s,n=10)

表2 菟絲子醇提液對衰老模型大鼠肝組織cyclinD1基因表達的影響(±s,n=10)

組別 cyclinD1/β-actin 陽性細胞數(%)青年對照組 1.22±0.10 48.45±7.39衰老模型組 0.71±0.141) 9.40±3.141)給藥15 d組 0.96 ±0.121)2) 26.39 ±5.251)2)給藥30 d組 1.03 ±0.141)2)3) 29.40±5.34 1)2)3)給藥45 d組 1.15 ±0.131)2)3) 44.34±4.57 1)2)3)

圖1 各組大鼠肝組織p16 mRNA的表達

圖2 肝細胞p16蛋白表達(×400)

圖3 各組肝細胞cyclinD1蛋白表達(×400)

圖4 各組大鼠肝組織cyclinD1 mRNA的表達

3 討 論

目前研究發現哺乳動物cyclin有9大類,主要有 cyclinA、B(1、2)、C、D(1、2、3)和 E 等,其中以 D1 的作用最為重要〔5〕,是大多數組織增殖所必需的。關于CyclinD1與衰老的關系已成不爭的事實,它通過與CDK結合成復合物,在細胞周期各相應時期發揮調節作用。本實驗研究結果說明D半乳糖衰老模型大鼠cyclinD1的表達水平明顯降低,而各菟絲子組則較模型組顯著提高。多數學者研究發現,細胞周期停滯是細胞衰老的一個關鍵特征,衰老細胞主要停滯于G1期,不能順利進人S期。Cyclin D1作用于G1/S期轉換過程,促使細胞從G1期進入S期。在G1期,cyclinD與 CDK4/CDK6結合,使后者激活,活化的CDK4可使Rb磷酸化,特別是磷酸化組蛋白Rb。在細胞的G1期,Rb與 E2F-DP1雜二聚體結合,在cyclin D-CDK作用下,磷酸化的Rb與雜二聚體分離,結合狀態的E2F變成游離狀態即可發揮啟動DNA合成的作用,從而促使細胞由 G1期進入S期〔6～10〕。衰老時 cyclin D1表達的下降,可能通過減少 CDK4活化,進而抑制Rb的磷酸化,從而減少E2F的游離,減慢細胞從G1進入S期,菟絲子醇提液通過上調cyclinD1的表達而增加cyclinD1的表達,可能通過 CDK4/CDK6的活化,催化 Rb磷酸化而加速 E2F與Rb分離,促使細胞進入 S期,而發揮延緩細胞衰老的作用。

p16是細胞周期依賴性激酶抑制因子(CDKI),是細胞周期的負調節因子,通過抑制CDK的活性使Rb正常地行使G1期阻滯功能,使細胞周期停止,阻斷細胞增殖〔11～13〕。衰老時的p16表達增加,可通過與cyclin D競爭性結合CDK4/CDK6,P16-CDK復合物不能使Rb磷酸化,抑制cyclin D1-CDK復合物的活性,使細胞阻滯在G1期。而菟絲子醇提液可以通過降低p16的表達,減少其與Cyclin D競爭結合CDK,而使cyclin D1激活CDK4的過程不受抑制,從而促進細胞從G1進入S期,發揮延緩衰老的作用。

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