曲美他嗪對急性心肌梗死大鼠膠原的影響

李佳彧 倪維華 李佳睿 馬丕勇 (吉林大學中日聯誼醫院，吉林 長春 30033)

急性心肌梗死(AMI)后心肌纖維化的程度是心室重構的重要部分。梗死后心肌纖維化包括心肌梗死區瘢痕組織中膠原網絡重構，同時伴有左室非梗死區心肌——遠離梗死區的心肌組織膠原增生〔1〕。因而，作為細胞間基質的主要成分——膠原，在心梗后心肌纖維化的發展過程中占有重要地位。調節膠原的合成與成熟成為臨床治療心室重構的重要治療靶點〔2〕。大量的循證醫學證實倍他樂克(琥珀酸美托洛爾)能夠有效抑制心梗后心室重構。有報道，曲美他嗪用于治療AMI，能夠改善心功能〔3〕，但其機制尚不十分清楚。本文通過建立實驗性AMI大鼠模型，測定梗死區、非梗死區膠原Ⅰ分子表達，進而探討曲美他嗪與倍他樂克對膠原合成的抑制及其對心肌纖維化進程延緩的機制。

1 材料與方法

1.1 試劑 倍他樂克由阿斯特拉(無錫)制藥有限公司生產。曲美他嗪由施維雅(天津)制藥有限公司生產。逆轉錄多聚酶鏈反應(RT-PCR)試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 動物模型及分組 隨機取健康80只(雌鼠30只，雄鼠50只)體重200～240 g Wistar大鼠，由吉林大學基礎醫學院動物室提供。采用左前降支冠狀動脈結扎術制備AMI模型，參考文獻〔4〕方法，應用4%水合氯醛麻醉，快速打開胸廓，暴露心臟，在左心耳下約2 mm處冠狀動脈左前降支用6/0線結扎，迅速關閉胸腔并縫合，復蘇動物。同時另取8只大鼠(雌鼠4只，雄鼠4只)，同樣的方法手術，但術中只掛線，不結扎，作為假手術組。術后每天予青霉素24萬U/kg，共3 d，預防感染。飼養8 w。術后AMI模型大鼠存活59只(雌鼠28只，雄鼠31只)存活率73.75%(雌鼠70%，雄鼠77.5%)。隨機選取存活鼠48只(雌鼠24只，雄鼠24只)，將其分為:模型組、倍他樂克組和曲美他嗪組各16只，每組大鼠雌雄各半。每日給藥量分別為倍他樂克組2 mg/kg體重，曲美他嗪組10 mg/kg體重。上述藥物溶于1 ml自來水中灌胃，模型組每日僅1 ml自來水灌胃。大鼠均自由飲食，分籠飼養，給藥過程中無一死亡。

1.3 標本采集及膠原-ⅠmRNA的檢測 8 w后處死大鼠，分別留取心臟的梗死區及非梗死區心肌組織，檢測各組織中膠原-Ⅰ蛋白mRNA的表達水平。用Trizol試劑處理梗死區心肌組織提取總RNA。使用逆轉錄酶將3 μg總RNA合成雙鏈DNA(互補DNA，cDNA)。膠原-Ⅰ，β-actin通過 GenBank獲得(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，并設計引物。膠原-Ⅰ上游引物5'-AGG GTC ATC GTG GCT TCT C-3'，下游引物5'-ACC TTC GCT TCC ATA CTC G-3'。β-actin上游引物5'-GCT CGT CGT CGA CAA CGG CTC-3'，下游引物5'-CAA ACA TGA TCT GGG TCATCT TCT C-3'。取3 μl逆轉錄產物分別應用上述蛋白上下游引物進行PCR擴增。PCR反應體系包括:10×反應緩沖液2.5 μl，1 μl dNTPs，上下游引物各 1 μl，1 μl TaqDNA 多聚酶，加DEPC處理H2O至總體積為25 μl，混勻后進行PCR反應。反應參數為:94℃預變性5 min，95℃變性40 s，54℃退火30 s，72℃延伸45 s，循環30次，最后72℃延伸10 min。取10 μl PCR反應產物進行1.5% 瓊脂糖電泳，光密度掃描后圖片經Image J軟件分析，結果以檢測蛋白/β-actin的積分光密度比值表示。

2 結果

2.1 梗死區心肌組織的膠原-ⅠmRNA的表達 與假手術組比較，模型組大鼠的梗死區心肌組織中膠原-Ⅰ mRNA表達上調(P﹤0.001)。與模型組比較，倍他樂克組表達下調(P﹤0.001)，曲美他嗪組表達亦下調(P﹤0.001)。其中，倍他樂克組與曲美他嗪組表達水平接近，差異不顯著(P＞0.05)。

圖1 各組梗死區心肌組織膠原ⅠmRNA的表達

圖2 各組非梗死區心肌組織膠原ⅠmRNA的表達

2.2 非梗死區心肌組織膠原-Ⅰ mRNA表達 與假手術組比較，模型組大鼠非梗死區心肌組織中膠原-Ⅰ mRNA表達上調(P＜0.01)。與模型組比較，倍他樂克組表達下調(P＜0.05)，曲美他嗪組表達亦下調(P＜0.05)。其中，倍他樂克組與曲美他嗪組表達水平接近，兩組間差異不顯著(P＞0.05)。

3 討論

心肌纖維化是AMI后心室重構的特征性改變，也是發展為心力衰竭的重要結構基礎〔5〕。抑制心梗后心肌組織纖維化過程是預防和治療心肌梗死的目標和重要靶點。心肌纖維化在分子水平上表現為間質內纖維細胞增殖和膠原生成增加。

大量研究已經證明倍他樂克能夠降低心梗和心衰患者的發病率和死亡率。曲美他嗪臨床治療AMI及改善預后的機制尚在探討中。故本實驗結果提示曲美他嗪對膠原-Ⅰ分子的合成具有顯著抑制作用，且與倍他樂克相似。且無論是梗死區還是非梗死區的心肌組織中膠原分子生成均顯著下降。

曲美他嗪通過選擇性抑制線粒體長鏈3-酮?；o酶A硫解酶，從而部分抑制長鏈脂肪酸β氧化;促進葡萄糖氧化〔6〕。曲美他嗪有效抑制心梗后膠原合成考慮與如下機制相關:心肌梗死后心肌梗死區修復過程通常分為兩個連續階段:炎癥階段和瘢痕形成階段。在炎癥階段，心肌缺血缺氧，有氧氧化受抑制，ATP產生不足，無氧酵解增強，乳酸堆積，細胞內酸中毒，使心肌收縮力下降，同時缺血，導致線粒體腫脹，氧化磷酸化障礙〔7～9〕。曲美他嗪利用有限的氧產生更多的ATP，提高氧利用率，增加心肌收縮功能，從而減少缺血期間細胞內酸中毒及鈣超載，保護心肌細胞〔10～12〕，且曲美他嗪能抑制白細胞向缺血部位聚積減少組織損傷〔13〕，減少壞死心肌細胞數量，能夠減少梗死面積;在瘢痕階段，曲美他嗪調節心肌細胞能量代謝，有效利用僅有的少量血供，增加殘存心肌活性，并使殘存心肌得到最有效的能量獲取途徑。也就是對于梗死區無論在心梗后心肌修復的炎癥階段，還是在心肌修復的瘢痕階段，曲美他嗪通過對心肌細胞能量代謝途徑的調節，下調組織中膠原分子的生成。對于非梗死區，由于改善心肌細胞的代謝途徑，同時清除氧自由基，減少心肌細胞損傷，進而減少成纖維細胞激活和膠原合成相關蛋白激活，從而減少了心肌組織中膠原合成。在分子水平上，心梗后梗死區和非梗死區膠原合成減少，成為延緩心肌纖維化、心室重構的重要基礎。同時該研究也證實倍他樂克在抑制心肌纖維化的進程方面有相似療效，與其他研究結果一致。膠原重構的調節對于抑制心梗后的心肌纖維化中具有重要意義，成為抑制心梗后左室重構的治療靶點〔14〕。

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