小窩蛋白-1反義寡核苷酸在AVP誘導大鼠心肌成纖維細胞增殖erk1/2信號轉導中的作用及辛伐他汀的干預效應

何燕萍 楊軍嶺 趙連友 劉少偉 (解放軍三二三醫院，陜西 西安 70054)

近年來，小窩和小窩蛋白的細胞生理作用日益受到人們的重視，尤其是在信號轉導、膽固醇運輸及腫瘤抑制等方面有著重要的意義〔1〕。目前一些研究也提示，小窩結構的標志蛋白是小窩蛋白，可能與高血壓的病理病生改變有關。文獻報道，小窩蛋白可調節細胞外基質重構和纖連蛋白基質的更新，從而參與高血壓的細胞外基質重構和組織修復病理病生過程〔2〕。并已證實，血管加壓素(AVP)在高血壓左室肥厚發生和發展中起重要作用〔3〕，心肌成纖維細胞(CFs)上有小窩蛋白-1大量表達〔4〕。AVP介導CFs增殖作用的信號轉導如何在小窩上實現，目前尚不清楚。研究還發現，適當的膽固醇水平對維持小窩結構十分重要，膽固醇與小窩蛋白的結合能穩定小窩蛋白寡聚體，從而協同小窩蛋白介導的信號轉導〔5〕。他汀類藥是目前具有廣泛心血管保護作用的以降低膽固醇為主的降脂藥物，其抑制CFs增殖的信號轉導機制是否與其降膽固醇作用并進而與影響小窩結構有關，目前還不十分明確。本研究設計合成小窩蛋白-1 AS ODN片段，旨在通過這種特異性抑制靶基因表達的細胞生物學研究手段，探討小窩蛋白-1在CFs增殖erk1/2信號轉導中的作用，以及辛伐他汀干預效應與小窩蛋白-1介導erk1/2信號轉導的關系，為他汀類防治高血壓心臟間質重構的發病機制提供新認識，也為他汀類藥物防治心臟重構提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性SD大鼠，體重200～250 g，6～8周齡，由第四軍醫大學實驗動物中心提供。AVP、甲基-β-環糊精(MβCD)、黃體酮(Pro)、膽固醇、erk1/2抗體、p-erk 1/2抗體、p21抗體、cyclinA抗體、cav 1抗體為Sigma公司產品，Western印跡熒光檢測試劑盒購自Santa Cruz公司，辛伐他汀純品由湖北絲寶藥業有限公司惠贈。

1.2 方法

1.2.1 心肌成纖維細胞(CFs)的培養和鑒定 腹腔麻醉(戊巴比妥50 mg/kg)6～8周齡SD大鼠后，無菌條件下迅速取出大鼠心臟，修剪去除心房和血管，僅留取心室部分。剪碎，PBS沖洗3次，加0.06%膠原酶Ⅱ和0.2%胰酶于37℃消化10～15 min，分 3次消化完畢。消化液經 100目濾網過濾，1 000 r/min離心共3次，每次用PBS清洗懸浮。所得細胞置于25 mm3培養瓶，100 ml/L胎牛血清的DMEM 100 ml培養瓶中，在37℃、50 ml/L CO2及飽和濕度下培養100 min，采用差速貼壁法分離CFs，待細胞生長近融合時，采用1∶3傳代。在倒置顯微鏡、透射電鏡下觀察培養的細胞呈梭形、多角形，細胞質透明，細胞核明顯變大，呈橢圓形，常含有2～3個核。經免疫組化纖維粘連蛋白染色陽性和平滑肌肌動蛋白染色陰性鑒定為所需的CFs，純度達0.98，錐蟲藍染色細胞活力大于0.97。實驗采用3～4代細胞。

1.2.2 cav1反義寡核苷酸設計及處理 根據大鼠cav1的腳手架域cDNA序列設計反義、正義及錯配寡核苷酸，序列運用Blast程序在GenBank數據庫進行同源性檢索，無同源序列。由上海生工有限公司合成，聚丙烯酰胺凝膠電泳純化，寡核苷酸分子兩端堿基均行硫代修飾，反義寡核苷酸序列如下〔6〕:5'-AAA CTG TGT GTC CCT TCT GG-3'，所有堿基均以硫代磷酸基修飾，并以該序列的錯義寡核苷酸為對照(錯義序列5'-AAA CAG TCT GAC CGT TGT GG-3')。將cav1-AS ODN用無血清DMEM稀釋后加樣，終濃度為5×10－5mol/L。用脂質體導入法將cav1-AS ODN導入CFs，孵育24 h后，檢測CFs的DNA合成，及p-erk1/2和cav1表達。

1.2.3 CFs的DNA合成功能測定 以3H-TdR摻入率反映CFs的DNA合成功能。取對數生長期CFs，0.25%胰酶消化，用含10%胎牛血清的DMEM調整細胞懸液濃度為1×104/ml，加入96孔培養板中，每孔加入200 μl，靜置培養至細胞接近融合。棄上清，加入無血清DMEM，繼續培養24 h，使細胞維持生長靜止狀態。分別加入不同試劑干預。在最后的干預藥物加入時，同時加入3H-TdR 7.4×104Bq/ml，12 h后吸棄上清液，二蒸水沖洗，加10%三氯乙酸洗5 min，加0.3 mol/L NaOH處理30 min，多頭細胞收集器收集細胞裂解液至玻璃纖維濾紙上，烤干。將玻璃纖維濾紙置于閃爍計數管中，每管加入閃爍液0.5 ml，液態閃爍計數儀測定放射性，結果以cpm值表示。

1.2.4 蛋白免疫印跡分析 收集不同條件處理的CFs，全細胞裂解液裂解細胞，4 000 r/min離心去除沉淀，BCA試劑測定蛋白含量。1×SDS凝膠加樣緩沖液調蛋白濃度使各組一致，用10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。收集CFs與等體積2×電泳加樣緩沖液混合后，煮沸5 min，每泳道上樣10 μl。采用蛋白提取液提取總蛋白，紫外分光光度計檢測蛋白含量。灌制15%的分離膠和4%積層膠，取每組細胞100 μg(20 μl)蛋白加入上樣孔，90 V恒壓垂直電泳2 h后，取出凝膠，在BioRad轉移槽中28 mA恒流濕轉18 h后，取出PVDF膜進行抗原抗體反應(cav1一抗稀釋濃度為1∶1 000，二抗為1∶3 000)。為觀察蛋白質轉移情況，對硝酸纖維素膜進行麗春紅S染色，觀察完畢后用去離子水將染液漂洗干凈，DAB顯色，待顯色適度時，用水漂洗終止顯色反應，凝膠成像系統掃描，軟件分析計算A值。erk 1/2抗體、p-erk1/2抗體、p21抗體、cyclin A抗體免疫印跡步驟同上，抗體濃度參照試劑說明書。

1.2.5 實驗分組 (1)空白對照組:無血清DMEM培養液;(2)AVP組;(3)Sim組;(4)cav1反義鏈單獨作用組;(5)cav1錯義鏈單獨作用組;(6)cav1反義鏈+AVP組;(7)cav1錯配鏈+AVP組;(8)MβCD 組;(9)Pro組;(10)15 μg/ml膽固醇組;(11)Pro+15 μg/ml膽固醇組;(12)MβCD+15 μg/ml膽固醇組;(13)Sim+膽固醇組:又分為Sim+10 μg/ml膽固醇組亞組、Sim+15 μg/ml膽固醇組亞組、Sim+20 μg/ml膽固醇組亞組;用DMEM調整AVP終濃度為1×10－7mol/L，Sim終濃度為10－7mol/L，cav1-AS ODN 終濃度為 5 μmol/L。每組設6～8個復孔。

2 結果

2.1 cav1反義寡核苷酸對大鼠CFs的DNA合成的影響cav1反義和錯義寡核苷酸分別導入大鼠CFs并孵育24 h后，大鼠CFs內3H-TdR摻入率分別相當于空白對照組(100±5)%的(157±7)%和(95±5)%，其中反義寡核苷酸組與空白對照組比較，差異非常顯著(P＜0.01)。錯義寡核苷酸組與空白對照組比較無統計學差異(P＞0.05)。在10－7mol/L的AVP單獨干預CFs 24 h后，大鼠CFs內3H-TdR摻入率相當于空白對照組的(172±4)%，與空白對照組相比，差異非常顯著(P＜0.01)。將 cav1反義或錯義寡核苷酸分別與10－7mol/L的AVP共同干預CFs 24 h后，大鼠CFs內3H-TdR酸摻入率分別相當于空白對照組的(212±6)%和(170±3)%，其中反義寡核苷酸+10－7mol/L的AVP共同干預組與10－7mol/L的AVP單獨干預組比較，差異非常顯著(P＜0.01)。錯義寡核苷酸+10－7mol/L的AVP共同干預組與10－7mol/L的AVP單獨干預組比較無統計學差異(P＞0.05)。

2.2 cav1反義寡核苷酸對大鼠CFs內erk1/2 MAPK活性的影響 cav1反義和錯義寡核苷酸分別干預大鼠CFs 5 min后，大鼠CFs內p-erk1/2蛋白表達量分別相當于空白對照組的(2.3±0.3)倍和(1.1±0.2)倍，其中反義寡核苷酸組與空白對照組比較，差異非常顯著(P＜0.01)。錯義寡核苷酸組與空白對照組比較無差異(P＞0.05)。10－7mol/L的AVP單藥干預CFs 5 min后，CFs內p-erk1/2蛋白表達量相當于空白對照組的(5.7±0.2)倍，與空白對照組相比，差異非常顯著(P＜0.01)。將cav1反義或錯義寡核苷酸分別與10－7mol/L的AVP共同干預CFs 5 min后，大鼠CFs內p-erk1/2蛋白表達量分別相當于空白對照組的(7.9±0.3)倍和(5.5±0.2)倍，其中反義寡核苷酸+10－7mol/L的AVP共同干預組與10－7mol/L的AVP單獨干預組比較，差異非常顯著(P＜0.01)。錯義寡核苷酸+10－7mol/L的AVP共同干預組與10－7mol/LAVP單獨干預組比較無差異(P＞0.05)。見圖1。

2.3 cav1反義寡核苷酸對大鼠CFs內p21和細胞周期蛋白A蛋白表達的影響 在用cav1反義寡核苷酸單獨干預或者與10－7mol/L的 AVP共同干預大鼠CFs 24 h后，兩組CFs內p21蛋白表達強度分別較對照組下降，細胞周期蛋白A表達強度升高。見圖2。

圖1 cav1反義寡核苷酸對大鼠CFs內erk1/2 MAPK活性的影響

圖2 cav1反義寡核苷酸對大鼠CFs內p21和細胞周期蛋白A蛋白表達的影響

2.4 膽固醇對大鼠CFs胞膜上cav1蛋白表達的影響 用2%的MβCD或10 μg/ml Pro或10－7mol/L Sim干預大鼠CFs 24 h后，CFs胞膜上cav1蛋白表達量分別相當于對照組(100±5)%的(61±3)%、(61±2)%和(66±4)%，與對照組比較，差異均非常顯著(P＜0.01)。

用15 μg/ml的膽固醇分別與2%的MβCD或10 μg/ml Pro共同干預CFs 24 h后，CFs胞膜上cav1蛋白表達量分別相當于對照組的 (86±2)%和 (86±3)%，與2%的MβCD或10 μg/ml Pro單獨作用組比較，統計學差異均非常顯著 (P＜0.01)。用10、15或 20 μg/ml膽固醇分別與 10－7mol/L Sim共同干預CFs 24 h后，CFs胞膜上cav1蛋白表達量分別相當于對照組的 (86±3)%、 (91±4)%和 (94±5)%，其中10 μg/ml膽固醇和 10－7mol/L Sim 共同干預與 10－7mol/L Sim單獨作用組比較，差異顯著 (P＜0.05)，15 μg/ml或20 μg/ml膽固醇+10－7mol/L Sim共同干預組與10－7mol/L Sim單獨作用組比較，差異均非常顯著 (P＜0.01)。15 μg/ml膽固醇單獨干預CFs 24 h后，CFs胞膜上cav1蛋白表達量相當于對照組的 (119±5)%，與對照組比較，統計學差異顯著 (P＜0.05)。見圖3。

圖3 膽固醇對cav1蛋白表達的影響

3 討論

信號轉導是近年來細胞生物學研究中的主要領域，心臟重構機制也與之關系十分密切。這種信號轉導過程首先是在生物膜上進行的，而究竟是在生物膜的什么部位，目前還不十分清楚。研究證實，細胞膜上小窩結構是許多信號分子完成跨膜信號轉導的“驛站”，小窩蛋白是小窩結構的標志性蛋白，可與信號分子直接接觸，調節細胞的功能狀態〔7〕。文獻還報道，絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)中，erk1/2信號通路的上游蛋白Ras、Raf-1和 erk1/2本身定位于小窩區域〔8〕。研究已證實，AVP可通過其V1受體誘導新生大鼠CFs增殖〔9〕，從而具有一定的促纖維化作用。本研究結果表明，AVP可活化erk1/2，同時增強細胞周期蛋白A表達，并抑制細胞周期蛋白抑制因子p21的表達，從而豐富了對AVP促增殖作用機制的認識。本研究采用cav1-AS ODN導入細胞后，可與編碼cav1的雙鏈或單鏈DNA結合，抑制剪接或降解目的mRNA，阻斷翻譯起始過程，也就是作用于cav1遺傳信息傳遞的各個步驟發揮其反義作用。研究表明，cav1-AS ODN對基礎狀態及AVP誘導的CFs增殖起促進作用，從而提示，升高cav1蛋白的表達水平可能會抑制AVP誘導的CFs增殖，進而發揮抗心肌纖維化作用。同時，小窩是細胞膜上富含膽固醇和鞘脂的膜微區，膽固醇對于維持小窩的完整性是必需的，是細胞內多種負性信號分子的錨定部位和信號分子對話(cross-talk)的重要場所，膽固醇對于維持小窩的完整及信號轉導起著重要作用〔5〕。黃體酮也有類似作用，并且主要影響小窩內的膽固醇水平。本研究用β-甲基環糊精和黃體酮干擾了細胞膜上的膽固醇水平后，cav1的表達減少，影響了小窩形成，進而干擾了小窩內的信號轉導。

目前關于他汀類藥物抗纖維化機制研究正處于初步認識階段，已經明確他汀類藥物對血清膽固醇水平正常的高血壓病患者有一定的降壓作用，可間接改善心肌的肥厚〔10〕，一方面與降低內源性膽固醇水平有關，另一方面可能抑制甲羥戊酸及類異戊二烯的合成，影響小G蛋白的成熟、定位和激活，從而阻斷MAPK途徑的激活等作用有關。然而，已研究表明類異戊二烯化在細胞膜上的網格蛋白而不是小窩內完成〔11〕。本研究表明Sim通過降低細胞膜上膽固醇水平，減少了cav1的表達水平。在增加細胞膜上的膽固醇水平后，cav1表達增加，可與Sim共同對erk 1/2增殖信號起負性調控作用。因此，對血清膽固醇水平正常的高血壓病患者在服用他汀類藥物的同時，適當地增加膽固醇類物質的攝入可能有利于他汀類藥物的抗心肌纖維化作用。

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