PAR-2在人胰腺癌細胞中的表達及吉西他濱的干預作用

劉 星 胡煜輝 肖游章 張曉春 周 青 徐建華 肖 鳳 羅友根 李曉飛

(井岡山大學醫學院重點實驗室，江西 吉安 343000)

最新研究表明，蛋白酶激活受體-2(proteinase activated receptor-2，PAR-2)與惡性腫瘤的增殖、侵襲轉移密切相關〔1〕。其他文獻也認為PAR-2能被其內源激活劑胰蛋白酶激活，從而影響組織功能〔2〕。綜合以上各種研究結果，筆者推測PAR-2在人胰腺癌細胞中具有很高的表達，而基于PAR-2相關的胰腺癌的治療方案也必將成為新的研究熱點。目前，吉西他濱是治療胰腺癌的首選藥物〔3〕。本研究擬從腫瘤病理學及分子生物學的最新理論出發，旨在研究PAR-2在人胰腺癌細胞中的表達態勢，并通過RT-PCR觀察吉西他濱對胰腺癌細胞中PAR-2表達的影響，初步探討吉西他濱治療胰腺癌的可能機制，為臨床應用提供實驗依據，同時也為胰腺癌基因靶向治療的進一步研究奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 人胰腺癌細胞株PANC-1購于中科院上海生物化學與細胞生物學研究所。

1.1.2 儀器與試劑 TRIzol Reagent(Invitrogen公司);逆轉錄和qPCR所用試劑分別為RevertAid First Strand cDNA synthesis Kit(Fermentas公司)，Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG(Invitrogen公司);DEPC水(Invitrogen公司);高糖DMEM(GIBCO公司);胎牛血清(蘭州民海生物工程有限公司)。定量PCR儀:BIO-RAD MJ Mini Opticon Real-Time PCR System，配套使用的軟件為BIO-RAD CFX Manager;雙人雙面垂直凈化工作臺(蘇州凈化設備有限公司);二氧化碳培養箱(Thermo公司);高速低溫離心機(Eppendorf公司);PAR-2引物由上海華大基因合成。注射用鹽酸吉西他濱(商品名:澤菲，江蘇豪森藥業，國藥準字H20030105)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及分組 人胰腺癌細胞株PANC-1培養選用含有10%新生牛血清的DMEM，置37℃、95%濕度、5%CO2的培養箱培養，待細胞長滿25 cm2培養瓶底部70% ～80%時，消化傳代，取對數生長期細胞用于實驗，按105個/孔接種于6孔培養板，并分為:cancer組(胰腺癌細胞陽性對照組)、Gao組(高劑量干預，吉西他濱給藥濃度50 μg/ml)、Zhong組(中劑量干預，吉西他濱給藥濃度5 μg/ml)、Di組(低劑量干預，吉西他濱給藥濃度0.5 μg/ml)，每個劑量設3個復孔。貼壁過夜后，用無血清DMEM同步化24 h，再給藥24 h，按試劑盒要求提取總RNA，逆轉錄后超低溫冰箱保存備用。取各組細胞分別進行基因擴增，以內參對照。正常胰腺組織取自南昌市第二醫院，設為normal組(正常胰腺組織陰性對照組):液氮研磨后，提取總RNA，按試劑盒要求逆轉錄后進行基因擴增。

1.2.2 逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR) 采用RNA分離試劑盒TRIzol提取并純化細胞總RNA;所有RNA樣本濃度均稀釋至1 g/L，用逆轉錄試劑盒進行逆轉錄，均按說明書進行。(1)RT-PCR引物序列見表1，GAPDH基因的 PCR產物大小為88 bp，PAR-2基因的PCR產物大小為222 bp。(2)PCR擴增反應體系:Mix 12.5 μl;SYBR Green I 5.0 μl;正向引物 1 μl;反向引物 1 μl;ddH2O 4.5 μl;cDNA 1 μl。(3)反應條件 Protocol:1:95.0℃ 6.00 min;2:95.0℃ 30 s;3:60.0℃ 30 s;4:72.0℃50 s;Plate Read;5:GOTO 2，65 more times;6:Melt Curve 65℃to 95℃:Increment 0.5℃ for 0.15 min;Plate Read。

1.2.3 計算 PCR軟件2-△△Ct方法進行統計分析，重復3次。①對所有的測試樣和校準樣本，用內參基因的CT值歸一目的基因的 CT值:△CT(test) = CT(target，test) － CT(ref，test);△CT(calibrator)=CT(target，calibrator) － CT(ref，calibrator)。② 用校準樣本的△CT值歸一試驗樣本的△CT值:△△CT=△CT(test)－△CT(calibrator)。③計算表達水平比率:2-△△Ct=表達量的比值。

得到的結果是通過參照基因表達水平標準的試驗樣本中目標基因相對于校準樣本的增加或減少的倍數，用參照基因校準目標基因表達的目的是彌補樣本組織量的差異。

表1 RT-PCR引物序列

1.3 統計學分析 以Quantity one分析軟件對實驗結果進行分析，試驗重復3次，計量數據以表示，采用SPSS13.0軟件。組間比較采用方差分析(Dunnett-t檢驗)。

2 結果

cancer組、Di組、Zhong組、Gao組中細胞 PAR-2 mRNA的相對表達量(15.94±0.25，5.70±2.03，5.36±0.17，6.85±2.00)均高于 normal組(1.00)，有顯著性差異(P＜0.001)。cancer組 ＞(Di組、Zhong組、Gao組)＞normal組;但是 Gao組、Zhong組、Di組三組間的相對表達量無顯著性差異(P＞0.05)。見圖1。

圖1 各組PAR2 mRNA水平

3 討論

PARs家族含有7個跨膜單位，與G蛋白相耦聯，可通過介導細胞外信號調節激酶信號轉道通路引起細胞核反應，激活多種細胞轉錄因子〔4〕。PARs主要有四個亞型-PAR-1、PAR-2、PAR-3和PAR-4，其中PAR-1、PAR-3和PAR-4是凝血酶受體，而PAR-2是胰蛋白酶的細胞表面受體〔5，6〕。由于PARs獨特的激活與滅活方式以及在消化系統中的廣泛分布，使其在消化系統中有非常重要的作用〔7〕，而PAR-2與消化系腫瘤的關系更是備受關注〔8〕。人PAR-2基因位于5q13染色體，小鼠PAR-2基因位于13D2，均為雙外顯子，是胰島素、肥大細胞纖維蛋白溶酶、凝血因子Ⅶa、Ⅹa和其他未知蛋白水解酶的受體〔9〕。在蛋白水平，人PAR-2是開放閱讀框編碼397個氨基酸的跨膜蛋白，與小鼠PAR-2的同源性為83%，與大鼠PAR-2的同源性為85%;在分子水平，PAR-2含有7個跨膜螺旋，氨基端位于細胞外，羧基端位于細胞內，C-末端與受體脫敏和信號轉導有關，N-末端有相應受體的蛋白酶裂解位點，易暴露于能使其激活的蛋白酶中，是許多消化系腺體外分泌的直接調控者〔10〕。

文獻報道PAR-2激動劑不但可以促進意識清醒的大鼠胰腺分泌〔11〕，也可促使離體大鼠胰腺及淀粉酶的分泌〔12〕;PAR-2在促進小鼠胰腺分泌淀粉酶的同時，也促進NO的產生〔13〕;在狗胰管的實驗中，PAR-2激動劑可迅速開放并迅速關閉離子通道〔14〕，而且可能與PAR-2在體內誘導的胰液瞬間分泌升高有關，但是PAR-2在胰腺癌細胞中的表達及其復雜機制目前仍不十分清楚。本研究中，筆者以Quantity one分析軟件對實驗結果進行分析，試驗重復3次，結果cancer組、Di組、Zhong組、Gao組中細胞PAR-2 mRNA的相對表達量均高于normal組。提示胰腺癌的發生、發展與PAR-2正相關。

吉西他濱是一種破壞細胞復制的二氟核苷類抗代謝物抗癌藥〔15〕，也是目前治療胰腺癌的最佳藥物。吉西他濱是去氧胞苷的水溶性類似物，對核糖核苷酸還原酶是一種抑制性的酶作用物的替代物，這種酶在DNA合成和修復過程中對所需要的脫氧核苷酸的生成是至關重要的〔14〕。本研究中，筆者將細胞分為cancer組(胰腺癌細胞陽性對照組)、Gao組(高劑量干預，吉西他濱給藥濃度50 μg/ml)、Zhong組(中劑量干預，吉西他濱給藥濃度5 μg/ml)、Di組(低劑量干預，吉西他濱給藥濃度0.5 μg/ml)及normal組(正常胰腺組織陰性對照組);并通過RT-PCR實驗觀察各組PAR-2 mRNA的相對表達量。結果cancer組＞Di組、Zhong組、Gao組＞normal組。提示相對于正常胰腺組織，PAR-2 mRNA在PANC-1胰腺癌細胞高表達，吉西他濱能夠降低PANC-1胰腺癌PAR-2 mRNA的表達率，可能是吉西他濱治療胰腺癌的作用機制之一。但是把3次PAR-2 mRNA基因表達量進行統計后，Gao組、Zhong組、Di組三組間的相對表達量差異無顯著性，即本實驗未發現吉西他濱對PAR-2 mRNA表達的干預作用與劑量有關，筆者認為還需要更多的研究以進一步探討。

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