賴型鉤端螺旋體溶血素HlyX對血管內皮細胞通透性的影響*

孫 湛，吳秉婷，李道坤，鮑 朗

(四川大學華西醫學中心感染免疫研究室，四川 成都 610041)

鉤端螺旋體(Leptospira，簡稱鉤體)在世界范圍內廣泛分布，可引起人獸共患自然疫源性疾病-鉤端螺旋體病(leptospirosis，簡稱鉤體病)[1]。鉤體病患者臨床癥狀明顯，嚴重者可出現腎功能障礙，黃疸，皮膚、臟器廣泛性出血，尤其是急性肺彌漫性大出血而致口鼻涌血死亡[2]。鉤體病導致急性肺彌散性大出血的機制仍未被闡明，因此對鉤體的致病機制研究仍具有十分重要的現實意義。賴型鉤端螺旋體全基因組測序結果預測了9個和鉤端螺旋體毒力相關的溶血素基因[3]。大多數溶血素在問號狀賴型鉤體中表達并且被分泌入環境中。其中HlyX(LA0378)是非鞘磷脂酶類溶血素，研究已發現該溶血素能在體外引起綿羊紅細胞溶血[4]，且促進ECV304細胞乳酸脫氫酶以及一氧化氮的釋放[5]，但其確切的對血管內皮細胞通透性以及對細胞凋亡率的影響尚無報道。本研究從賴型鉤端螺旋體56601株中克隆、表達hlyX基因，并將目的蛋白作用于HUVECs細胞株，檢測其對單層血管內皮細胞通透性的影響及其對細胞凋亡率的影響，探討該蛋白在鉤端螺旋體引起肺彌散性出血致病過程中可能起到的作用及可能機制。

材料和方法

1 材料

1.1 菌株、質粒和細胞 鉤端螺旋體賴型56601株由本研究室保存并定時感染豚鼠傳代以保持毒力。原核表達質粒pET32a(+)本室常規保種，感受態細胞E.coli BL21(DE3)pLysS購自 Tiangen。HUVECs細胞株，由四川大學華西醫院移植免疫實驗室提供。

1.2 主要試劑 PCR試劑盒、DNA連接試劑盒(TaKaRa);膠回收純化試劑盒以及質粒提取試劑盒(Omega);限制性內切酶 Kpn I、EcoRⅠ、DNA markerⅣ、protein Marker(Fermentas);BCA protein assay reagent kit(Pierce);抗His蛋白的單克隆抗體(Ⅰ抗)以及羊抗鼠IgG-HRP(Ⅱ抗)(北京天根公司);DAB顯色液(北京中衫公司);蛋白純化柱HisTrap純化柱(GE);Millicell hanging cell culture(pore size 0.4 μm，diameter 6.5 mm)(Millipore);HRP-albumin(博士德公司);其余常規試劑均為國產或進口分析純產品。

2 方法

2.1 賴型鉤體56601株基因組提取與純化 應用基因組提取試劑盒提取基因組。

2.2 hlyX基因PCR擴增 根據GenBank中hlyX基因序列設計。上游和下游引物分別引入EcoR I和XhoI酶切位點。P1:5'-CGGAATTCTTGGTCGAAGCGCTGTCTGT-3';P2:5'-GGCCTCGAGATCCAATTTTTCGGTTTCTAG-3'(劃線部分分別是 EcoR I和 Xho I酶切位點，Invitrogen合成)。以賴型鉤體56601株全基因組DNA為模板，P1、P2為引物按以下反應體系進行PCR擴增:5×PrimerSTARTMbuffer(Mg2+plus)10 μL，dNTP mixture(各 2.5 mmol/L)4 μL，P1、P2 各 1.0 μL，基因組DNA1 μL，PrimerSTARTMHS 0.5 μL，H2O 32.5 μL。反應參數:98 ℃ 10 s，55 ℃ 5 s，72 ℃ 1 min，30個循環。反應結束后取5 μL擴增產物用0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果。

2.3 重組質粒pET-hlyX的構建和鑒定 hlyX與質粒pET32a(+)分別用限制性內切酶EcoR I和Xho I酶切，純化。hlyX與pET32a(+)以摩爾比3∶1混和，用DNA連接試劑進行連接反應，轉化BL21(DE3)pLysS感受態細胞，鋪板過夜培養，隨機挑取轉化菌落于LB培養基振蕩培養，提取質粒DNA，作雙酶切和PCR鑒定，以上鑒定正確的陽性克隆送上海英駿生物技術有限公司測序。

2.4 重組質粒pET-hlyX在大腸桿菌中的誘導表達 將含重組質粒 pET-hlyX、空白對照質粒pET32a(+)以及不含質粒大腸桿菌BL21(DH3)分別接種于LB培養基過夜振蕩培養，第2 d取菌液按1∶100接種于新鮮LB培養基(氯芐西林100 mg/L)培養3 h，加入IPTG至終濃度0.5 mmol/L，5 h后收集菌液經反復凍融、離心處理，分別取上清和沉淀作SDS-PAGE分析。

2.5 HlyX融合蛋白和Trx蛋白的大量表達及純化、復性和免疫印跡分析 挑取單克隆菌落于5 mL LB培養基中37℃振蕩培養過夜(氯芐西林100 mg/L)，第2 d按1∶50加入到300 mL LB培養基中(氯芐西林100 mg/L)，37℃振蕩培養3 h，加入終濃度為0.5 mmol/L IPTG，繼續誘導培養5 h，離心集菌，超聲破碎。棄上清，用洗滌液A(50 mmol/L Tris-HCl、10 mmol/L EDTA、100 mmol/L NaCl、0.5%Triton X-100)洗滌沉淀，重懸沉淀，室溫靜置30 min，洗滌液B(50 mmol/L Tris-HCl、10 mmol/L EDTA、100 mmol/L NaCl、2 mmol/L尿素)洗滌沉淀，重懸沉淀，室溫靜置30 min，4℃12000 r/min離心10 min，棄上清。以8 mol/L尿素重懸包涵體，室溫靜置30 min，4℃過夜。4℃12000 r/min離心10 min，收集上清。按照HisTrap純化柱所提供的方法純化融合包涵體蛋白。將純化的Trx-HlyX蛋白進行尿素梯度透析復性，取上清進行SDS-PAGE檢查純化效果。將Trx-HlyX蛋白溶液作Western blotting，Ⅰ抗為鼠抗His-tag抗體，Ⅱ抗為HRP標記羊抗鼠IgG。測定蛋白濃度，將純化后的目的蛋白用Millipore的超濾管4℃反復離心去除咪唑，用去內毒素膠預裝柱處理，即先用1%脫氧膽酸鈉再生去內毒素膠，再用無致熱源的三蒸水平衡預裝柱，最后將蛋白緩慢上柱，收集流出液即為去除內毒素的蛋白。-70℃貯存備用。

2.6 內皮單細胞層通透性的測定 HUVECs以2×105cells/cm2接種在鋪有1%明膠的頂層小室微孔膜上(孔徑大小0.4 μm，直徑6.5 mm)，待細胞長至融合后，改用無酚紅無血清DMEM繼續培養8 h，使細胞獲得同步生長并處于靜止期。在陰性對照組各孔中加入Trx標簽蛋白液50 μL，在蛋白作用組各孔中加入Trx-HlyX融合蛋白液50 μL至終濃度分別為5、10、20、40 mg/L，每個濃度重復5孔。繼續培養細胞。24 h后加100 μL(1 g/L)HRP-白蛋白到雙層小室的頂室，37℃、5%CO2孵育1 h，隨后從每個雙層小室的頂室和底室分別取樣品100 μL，置于黑色96孔板中，并向每孔中都加入100 μL TMB后加入2 mol/L H2SO4終止反應。酶標儀在450 nm波長測定吸光度(A)值。

2.7 細胞凋亡檢測

①Annexin V-FITC/PI雙染法流式細胞術檢測細胞凋亡 取HUVECs單細胞懸液，往96孔板各孔中加入100 μL細胞液，培養24 h后將實驗分陰性對照組和蛋白作用組:在陰性對照組各孔中加入Trx標簽蛋白液50μL，在蛋白作用組各孔中加入Trx-HlyX融合蛋白液 50 μL 至終濃度分別為 5、10、20、40 mg/L，每個濃度重復5孔。繼續培養細胞，24 h后收集細胞按如下方法處理:用不含EDTA的胰蛋白酶消化收集各孔細胞;冰PBS洗滌2次(2000 r/min離心5 min)收集(1-5)×105細胞;加 500 μL binding buffer懸浮細胞和5 μL Annexin V-FITC混勻后，再加入5 μL propidium iodide混勻，室溫、避光、反應5-15 min;經流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

②Hoechst 33258熒光染色觀察細胞凋亡 按上述方法處理細胞，除去培養基，用PBS洗2遍，用免疫染色固定液固定(4℃，過夜)，棄除固定液，PBS洗3遍，每次5 min，加入0.4 mL Hoechst 33258染色液，染色 10 min后，棄除染色液，PBS洗 3遍，每次5 min，滴加抗熒光淬滅封片液。熒光顯微鏡下(激發波長為350 nm，發射波長為460 nm)檢測各組呈藍色細胞核的細胞。

3 統計學處理

結 果

1 賴型鉤體56601株hlyX基因PCR擴增

以賴型鉤體56601株全基因組為模板，通過PCR擴增出約1200 bp左右的特異性片段，與預期的大小一致，見圖1。

2 重組質粒的構建與鑒定

提取重組質粒雙酶切結果顯示該重組質粒含有約1200 bp片段，PCR結果顯示該重組質粒能擴增出目的片段，而空質pET32a(+)未能擴增出。測序結果和GenBank數據庫中hlyX 100%匹配，表明重組質粒構建成功，見圖2。

Figure2.Analysis of recombinant plasmid pET-hlyX.M:DNA markerⅣ;Lane 1:plasmid pET32a(+);Lane 2:recombinant plasmid pET-hlyX;Lane 3:PCR products amplified from recombinant plasmid with primer P1 and P2;Lane 4:pET-hlyX digested with Xho I and EcoR I restriction enzyme;Lane 5:PCR products amplified from plasmid pET32a(+).圖2 重組質粒pET－hlyX的鑒定

3 重組質粒的誘導表達和免疫印跡分析

SDS-PAGE結果顯示，含重組質粒pET-hlyX菌體總蛋白在約65 kD處出現明顯條帶，且以包涵體的形式存在，空質粒菌體蛋白在20 kD處出現條帶。Trx-HlyX融合蛋白和Trx蛋白經HisTrap親和層析柱純化后得到較高純度的蛋白，見圖3。

4 Trx－HlyX融合蛋白對HUVECs通透性的影響

結果顯示，隨著Trx-HlyX融合蛋白濃度增加，HUVECs單層細胞的通透性依次增加，5 mg/L、10 mg/L組與對照組沒有明顯差異，但當Trx-HlyX蛋白作用濃度超過20 mg/L，與對照組相比，差異顯著(P ＜0.05)，見圖4。

Figure3.Detection of Leptospira HlyX and Trx fusion partner expressed in E.coli.A:SDS-PAGE was performed in SDS-12%polyacrylamide gel and stained with Coomassie brilliant blue;B:immunoblot analysis was performed with the mouse anti-his tag monoclonal antibody.E.coli harboring pET-HlyX was induced by IPTG(1 mmol/L)for 5 h at 37℃，and sonic lysates were separated into soluble and insoluble fractions by centrifugation.A:M:molecular mass marker;Lane 1:soluble fraction from E.coli lysate harboring pET32a(+)induced by IPTG;Lane 2:insoluble fraction from E.coli lysate harboring pET32a(+)induced by IPTG;Lane 3:soluble fraction from E.coli lysate harboring pET-HlyX induced by IPTG;Lane 4:insoluble fraction from E.coli lysate harboring pET-HlyX induced by IPTG;Lane 5:purified 52 kD Trx-HlyX fusion protein;Lane 6:purified 20.4 kD Trx fusion partner.B:Lane 1:20.4 kD Trx fusion partner protein;Lane 2:62 kD pET-HlyX fusion protein.圖3 重組質粒pET－HlyX以及標簽蛋白Trx在大腸桿菌中表達

Figure4.HlyX fusion protein increased permeability in a HUVECs barrier model.The confluent monolayer HUVECs in the top chamber of the barrier model were pre-treated with Trx fusion partner or HlyX(5，10，20 or 40 mg/L)for 24 h.The values were normalized against those for untreated(control)cells..n=5.*P＜0.05 vs control group.圖4 HlyX融合蛋白對HUVECs單層細胞通透性的影響

5 Trx－HlyX融合蛋白對HUVECs細胞凋亡率的影響

應用流式細胞術檢測，經Trx-HlyX融合蛋白作用24 h的HUVECs細胞，細胞凋亡率隨著蛋白濃度的增加而增加，呈劑量依賴關系。當蛋白濃度達到20 mg/L，與對照組相比差異顯著(P＜0.05)，說明該蛋白有一定的細胞毒性作用，見圖5。Hoechst 33258熒光染色結果(圖6)顯示:A組(陰性對照組):細胞核較大，出現均勻的低強度熒光，凋亡細胞數目極少;B組、C組(Trx-HlyX 5 mg/L、10 mg/L):有數目極少的強度很高的藍色亮點，與A組比較無明顯差別;D組(Trx-HlyX 20 mg/L):有較多的高強度的藍色亮點，有部分細胞發生凋亡;E組:有大量強度高的藍色亮點，較多細胞發生凋亡。

Figure5.The of apoptotic rate of HUVECs assayed by Annexin-V/PI double-staining flow cytometry.The percentages of apoptotic cells in the presence of HlyX fusion protein increased in a concentration-dependent manner..n=5.*P＜0.05 vs control group.圖5 Annexin V－FITC/PI雙染法流式細胞術檢測凋亡HUVECs的比例

討 論

由致病性鉤端螺旋體所引起的鉤體病是世界范圍內流行的人獸共患自然疫源性疾病。鉤體病的主要癥狀包括發熱、肌肉酸痛和乏力，嚴重者表現為黃疸、溶血性貧血以及肝腎肺功能障礙，部分患者會因彌漫性肺出血而死亡。鉤體病導致急性肺彌散性大出血的機制仍未被闡明。許多闡述僅僅只是推測，皆有待于實驗的驗證。關于鉤體引起肺出血機制的認識，有學者提出毒力蛋白機制[6]。其認為鉤體通過毒力蛋白作用引起血管損傷，尤其是小血管炎性損傷，進而引起出血[7]。雖然特異性毒力蛋白并未闡明，但是可能的毒力蛋白包括有外膜蛋白、膜糖脂蛋白、溶血素以及脂多糖[8]。

Figure6.Hoechst 33258 nuclear staining for assessment of apoptosis of HUVECs.A:control;B-E:HUVECs were treated with 5，10，20 or 40 mg/L HlyX fusion protein，respectively，at 37 ℃ for 24 h.圖6 Hoechst33258細胞核染色檢測人臍靜脈內皮細胞的凋亡

溶血素存在于一些鉤體培養物的上清液中，能破壞紅細胞或其它細胞膜，增加毛細血管的滲透性，使血管壁破裂造成皮下出血，是鉤體的一個重要的致病因子。通過分析問號鉤體黃疸出血型賴型全基因組CDS，發現大染色體上存在9個可疑的溶血素[9]。HlyX屬于非鞘磷脂酶類溶血素，能引起成孔蛋白類溶血，可通過在紅細胞或其它細胞膜表面形成穩定的穿膜小孔，使細胞膜的滲透性增高，離子和分子可以自由穿過脂質雙分子層，導致細胞外液涌入而使細胞裂解。已有實驗證明，在大腸桿菌中表達的HlyX有明顯的溶血活性，與LipL32共同作用于綿羊血紅細胞，溶血作用明顯增強，表現為協同作用，如果同時使用它們的抗體能夠阻止溶血作用[4]。

本研究通過克隆表達出溶血素蛋白Trx-HlyX，使其作用于人臍靜脈內皮細胞，采用生物素標記白蛋白的酶聯免疫吸附法測定人臍靜脈內皮細胞單細胞層通透性的變化，并應用流式細胞術檢測其對血管內皮細胞凋亡率的影響。本研究發現，在體外用不同劑量的融合蛋白Trx-HlyX作用于人臍靜脈內皮細胞，當目的蛋白達到一定劑量時，可引起單層血管內皮細胞的通透性增大，而標簽蛋白Trx則沒有這樣的作用。隨著Trx-HlyX蛋白作用于HUVECs劑量上升，細胞凋亡率也有上升趨勢。

血管內皮細胞損傷在鉤體病早期就會出現。血管損傷主要會表現在毛細血管，但是其導致出血的機制仍未被闡明。通過本實驗研究可推測，溶血素蛋白HlyX可能通過引起細胞凋亡數量增加，而導致血管內皮細胞的通透性增加。我們通過實驗已證實，溶血素蛋白HlyX作用的血管內皮細胞LDH和NO釋放量明顯增高，對細胞具有毒性效應[6]。所以推測，血管內皮細胞壞死量增加，可能也是導致血管內皮細胞通透性增加的原因。另外，血管內皮細胞之間的緊密連接被破壞，可能也影響單層細胞的通透性，其具體機制有待進一步深入研究。

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