MMP－9和iNOS在胎膜早破胎膜組織中的表達及相關性研究

范建輝， 崔金暉， 滕奔琦， 陳新娟， 侯紅瑛

(中山大學附屬第三醫院產科，廣東 廣州 510630)

胎膜早破(premature rupture of membranes，PROM)是指在臨產前胎膜發生破裂，是影響母兒健康安全常見的并發癥之一，包括足月胎膜早破(term premature rupture of membranes，tPROM)和早產胎膜早 破(preterm prematureruptureofmembranes，pPROM)。國內統計發現［1］，PROM 占足月妊娠的10%，占早產的2% －3.5%，30% －40%的早產和pPROM有關［2］。發生胎膜破裂后由于其屏障作用消失，使得圍生期母兒的發病率、死亡率升高。國內外學者對PROM的病因及發病機制進行了長期大量的研究，但其確切的病因及發病機制至今仍未明確，本研究通過檢測基質金屬蛋白酶－9(matrix metallproteinase－9，MMP－9)和誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)在胎膜組織中的表達，探討PROM發生的相關機制。

材料和方法

1 材料

1.1 研究對象 選取2010年4月－2011年1月我院行規律產檢并臨產前行剖宮產終止妊娠者共60例，均無復發性流產，無吸煙、酗酒、吸毒等不良生活習慣，排除妊娠合并內外科疾病、妊娠期并發癥，其中pPROM組、tPROM組、正常足月妊娠組(對照組)各20例，經統計學分析，3組孕婦的年齡、孕產次無顯著差異。

1.2 器材及試劑 恒溫機(Thermo)，離心機(Thermo)，酶標儀(Thermo)，微量加液器(Eppendorf)，iNOS兔抗人多克隆抗體(ab3523，Abcam)，MMP－9兔抗人多克隆抗體(ab76003，Abcam)。二步法抗兔/鼠通用型免疫組化檢測試劑盒，內含試劑:ChemMateTMEnVisionTM/HRP(兔/小鼠)、DAB緩沖稀釋液和DAB原液(GK500705/10，上海基因科技公司)。人MMP－9酶聯免疫分析(ELISA)試劑盒(Uscnlife)。

2 方法

2.1 診斷標準 根據早孕B超及停經時間準確核對孕周，PROM診斷標準參考全國高等學校教材《婦產科學》第7 版［1］標準。

2.2 標本收集 所有病例均于剖宮產術前常規留取靜脈血3 mL，術中切開子宮肌層、暴露胎膜后用注射器抽取羊水3 mL。標本放于－4℃冰箱中過夜后離心20 min，取上清液放于－20℃冰箱保存待測。胎盤娩出后立即在無菌條件下取胎膜破口處胎膜組織5－10 g，無菌生理鹽水沖洗去除血跡及羊水，置于10%甲醛固定24－48 h后行常規石蠟包埋，切片、烤片，其中每個標本切片4張(5 μm)，分別進行HE染色和iNOS、MMP－9免疫組化染色，另一張備用或者用作陰性對照。

2.3 結果判斷

①HE染色 顯微鏡觀察中性粒細胞浸潤，每高倍鏡視野5－10個為輕度，11－30個為中度，＞30個為重度，中－重度中性粒細胞浸潤者判斷為絨毛膜羊膜炎［3］。

②免疫組織化學染色 MMP－9和iNOS均表達在細胞漿中，以細胞漿中出現棕黃色顆粒為陽性，與背景顏色一致或無明顯著色為陰性，隨機選擇5個高倍視野(×400)，參照 Barnes等［4］進行綜合評分，見表1。

表1 MMP－9和iNOS在胎膜組織中表達的評分Table 1.The scoring of MMP－9 and iNOS expression in fetal membranes

3 統計學處理

結 果

1 MMP－9在胎膜組織中的表達

MMP－9在 tPROM 組(圖 1B)、pPROM 組(圖1C)孕婦胎膜中的表達水平均高于對照組(圖1A)，差異顯著(均P＜0.01)。MMP－9在tPROM組孕婦胎膜中的表達與pPROM組比較，無顯著差異(P＞0.05)，見表 2。

Figure 1.The immunohistochemical staining of MMP－9(×400).A:normal group;B:tPROM group;C:pPROM group.圖1 MMP－9的免疫組化染色

表2 MMP－9在胎膜組織中的表達Table 2.The expression of MMP－9 in fetal membranes of the three groups(n=20)

2 孕婦血清、羊水中MMP－9水平比較

MMP－9在3組孕婦不同組間母血及羊水的表達水平比較，pPROM組＞tPROM組＞對照組，差異顯著(P ＜0.01)，見表3。

表3 MMP－9在血清及羊水中的表達Table 3.The level of MMP－9 in serum and amniotic fluid in the three groups(ng/L..n=20)

表3 MMP－9在血清及羊水中的表達Table 3.The level of MMP－9 in serum and amniotic fluid in the three groups(ng/L..n=20)

＊＊P ＜0.01 vs control;##P ＜0.01 vs tPROM.

Group Serum Amniotic fluid Control 89.74 ±22.85 51.48 ±22.59 tPROM 371.10 ±134.83＊＊ 100.04 ±26.50＊＊pPROM 208.76 ±103.82＊＊## 71.36 ±20.49＊＊##

3 iNOS在胎膜組織中的表達

iNOS在炎癥細胞中高表達，在pPROM組(圖2C)孕婦胎膜中的表達水平高于對照組(圖2A)，差異顯著(P＜0.01);iNOS在 tPROM 組(圖2B)孕婦胎膜中的表達與對照組比較，無顯著差異(P＞0.05)，與pPROM組比較，無顯著差異(P＞0.05)，見表4。

Figure 2.The immunohistochemical staining picture of iNOS(×400).A:normal group;B:tPROM group;C:pPROM group.圖2 iNOS的免疫組化染色圖片

表4 iNOS在胎膜組織中的表達Table 4.The expression of iNOS in fetal membranes of the three groups(n=20)

4 MMP－9、iNOS與絨毛膜羊膜炎的關系

60例孕婦的胎膜組織全部進行HE染色，其中絨毛膜羊膜炎(圖3B、C)18例，非絨毛膜羊膜炎(圖3A)42例。MMP－9在絨毛膜羊膜炎胎膜中的表達水平高于非絨毛膜羊膜炎者，差異顯著(P＜0.05)，iNOS在絨毛膜羊膜炎胎膜中的表達水平高于非絨毛膜羊膜炎者，差異顯著(P ＜0.01)，見表5、6。

Figure 3.The hematoxylin and eosin(HE)staining of fetal membranes(×200).A:normal fetal membranes;B:mild chorioamnionitis;C:severe chorioamnionitis.圖3 胎膜組織的HE染色

表5 絨毛膜羊膜炎與MMP－9表達的相關性Table 5.The relationship between chorioamnionitis and MMP－9 expression

表6 絨毛膜羊膜炎與iNOS表達的相關性Table 6.The relationship between chorioamnionitis and iNOS expression

5 對孕婦胎膜中MMP－9和iNOS的表達做相關分析

相關分析表明MMP－9與iNOS在胎膜中的表達水平呈正相關(r=0.476，P ＜0.01)，見表7。

表7 MMP－9和iNOS表達的相關性Table 7.The relationship between MMP－9 and iNOS expression

討 論

孕期胎膜可以使羊膜腔保持無菌狀態，為胎兒的生長發育提供一個穩定的內環境。隨著孕周的增大，胎膜發生相應變化使其適應逐漸增長的子宮壓力及宮腔容量。近年來，國內外學者們主要從感染、營養、經濟狀態、社會因素等宏觀方面以及細胞凋亡、炎性細胞因子、胎膜酶、氧化應激、基因多態性等微觀方面對PROM的病因及發病機制進行研究，表明這幾個因素在PROM的發病機制中均起到一定作用，而且它們之間也存在著相互作用，目前多數學者認為PROM的發病應該是多因素、多途徑共同相互作用的結果。

1 MMP－9與PROM

基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是一種降解和破壞細胞外基質的蛋白水解酶，其中MMP－9屬于明膠酶B類，是PROM中研究最多的一種基質金屬蛋白酶，Mclaren等［5］證實分娩發動前宮頸處胎膜中MMPs尤其是MMP－9的活性顯著升高，認為MMP－9參與胎膜中膠原的程序性溶解重建過程，Maymon等［6］發現分娩發動后羊水和胎膜中MMP－9活性明顯升高，PROM患者MMP－9在宮頸處胎膜中的濃度比其它地方高，且胎膜中Ⅳ型膠原含量下降明顯，與MMP－9的上升具有相關性，提示了MMP－9可能是胎膜破裂發生的重要生理基礎。當MMP－9表達過度時，細胞外基質降解加快，導致胎膜強度、韌性下降，胎膜結構弱化，可造成PROM的發生。本研究結果顯示MMP－9在3組胎膜中均有一定程度的表達，尤其在羊膜上皮細胞中呈高表達，與文獻報道一致［7］。同時顯示tPROM組、pPROM組孕婦血清、羊水及胎膜組織中MMP－9的表達水平均高于對照組(P＜0.01)，證實了MMP－9的正常表達在孕期維持胎膜完整性方面起著重要作用。

2 iNOS與PROM

一氧化氮(nitric oxide，NO)是20世紀80年代發現的一種多功能因子，除了參與許多生理功能外，NO還與眾多疾病發生發展密切相關。NO結構簡單，性質極不穩定，容易擴散，其生物半衰期只有5 s左右，故對NO的認識大都集中在對NOS的測定。國外學者［8］利用反轉錄多聚酶鏈反應技術分析表明，妊娠期NO變化主要由iNOS引起。本實驗結果顯示iNOS在pPROM組孕婦胎膜中的表達水平高于對照組，差異顯著(P＜0.01)，故可以推斷 iNOS在pPROM發病中起到重要作用，此外，本實驗結果顯示iNOS在tPROM組孕婦胎膜中的表達與對照組比較，差異無顯著(P＞0.05)，提示tPROM與pPROM可能存在不同發病機制，而iNOS在pPROM組孕婦胎膜中的表達與tPROM組比較，差異無顯著(P＞0.05)，iNOS可能并不參與足月胎膜早破的發病，但是也可能與本實驗研究例數較少有關。

3 MMP－9、iNOS與絨毛膜羊膜炎

目前，大量的臨床醫學、流行病學、組織學、微生物學和分子生物學資料提示感染與炎癥在PROM的發生中占主要原因［9］，且互為因果，當胎膜破裂后細菌通過上行性感染傳播到胎膜，誘導或者加重絨毛膜羊膜炎的發生。有國內學者統計發現，pPROM患者中一半與絨毛膜羊膜炎相關［10］。正常情況下MMP－9在體內的合成、分泌、降解均受到嚴格調控，研究顯示細胞因子如IL－6、8、TNF－α及脂多糖［11］等分泌增加可激活MMP－9合成的轉錄因子如細胞核因子 NF－κB，引起 MMP－9的合成增加，同時MMP－9也可以激活IL－8等，使炎癥反應加劇，二者形成正反饋調節［12］。本實驗中有絨毛膜羊膜炎孕婦18例，MMP－9在絨毛膜羊膜炎組孕婦胎膜中的表達水平高于非絨毛膜羊膜炎組，差異顯著(P＜0.05)，說明MMP－9表達和體內的炎癥反應密不可分，可能參與了絨毛膜羊膜炎的發生，并在感染所致的PROM中發揮重要作用。

妊娠是一個復雜的免疫調控過程，炎癥是免疫紊亂發生發展的重要病理機制，iNOS在正常情況下呈低表達，當炎癥發生時誘導iNOS表達產生NO，NO經過多種途徑，在妊娠感染中調節殺菌機制，使胎兒在胎盤屏障破壞的情況下仍進一步受到保護。當炎癥因子持續存在時可使NO水平持續升高，引起炎癥級聯瀑布反應，將信號波及范圍擴大，推動炎癥發展。本實驗發現iNOS在胎膜中的炎性細胞中高表達，且iNOS在絨毛膜羊膜炎組孕婦胎膜中的表達水平明顯高于非絨毛膜羊膜炎組(P＜0.01)，說明iNOS與炎癥反應密不可分，炎癥或感染可以導致iNOS的高表達，iNOS的高表達同時也促進了絨毛膜羊膜炎的發生發展，使得妊娠期免疫系統發生紊亂導致胎膜早破的發生。

4 MMP－9、iNOS與PROM

近年來有學者［13］研究發現，在小鼠胚胎著床期應用NO抑制劑抑制NO的產生會影響MMP－2、MMP－9、TIMP－3的基因表達，從而導致影響胚胎著床，從而得出結論NO表達可能激活MMP表達。本研究中我們對60例孕婦胎膜中MMP－9和iNOS的表達進行了Spearman秩相關分析，發現MMP－9與iNOS在胎膜中的表達水平呈正相關(P＜0.01)，說明MMP－9、iNOS二者在PROM發病中存在關聯，NO可能會激活胎膜中的MMP－9，參與胎膜的破裂。生理過程中，NO參與體內環鳥苷酸的(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)的產生，所以 NO 可能會通過影響細胞內信號通路中cGMP的產生從而影響MMP－9的表達，另一方面，NO也可能通過影響其它細胞因子的表達間接影響MMP－9的表達及活性［14］，作為一種多功能分子，NO也可能直接參與MMP－9的表達的信號轉導途徑，具體的機制需要進一步研究。Yuan等［15］實驗研究發現絨毛膜細胞iNOS的表達使NO產生增多，可以誘導細胞凋亡，從而導致組織活性細胞減少，從而影響膠原纖維合成及細胞外基質沉積，胎膜韌性下降，局部胎膜變薄導致胎膜破裂，故推斷NO與PROM的發病可能存在密切相關。

綜上所述，MMP－9和iNOS表達升高與pPROM及絨毛膜羊膜炎的發生相關，MMP－9和iNOS在PROM發病機制中存在關聯作用，如果通過選擇性的iNOS抑制劑干擾導致炎癥瀑布反應的信號轉導通路，抑制iNOS過量表達而抑制過量NO的產生，可同時下調 MMP－9的表達，有可能減少或預防PROM的發生。

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