不穩定型心絞痛患者MCP-1-2518G/A多態性和血清單核細胞趨化蛋白水平的相關性

何國平 姜 九 師干偉 許聯紅 戚傳平 (江蘇大學附屬武進醫院心血管內科，江蘇 常州 23002)

不穩定型心絞痛(UAP)是嚴重危害人類健康的主要疾病之一，炎癥反應在其發病過程中發揮重要作用〔1〕。單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)能誘導斑塊內細胞表達某些炎癥因子、基質金屬蛋白酶和組織因子等使原來穩定的斑塊變成易損斑塊并發生破裂和繼發血栓形成而導致急性冠脈綜合征(ACS)的發生〔2〕。流行病學研究表明，血清MCP-1水平與ACS密切相關，且血清MCP-1水平明顯升高的ACS患者預后差〔3，4〕。弗明翰心臟病中心的研究〔5〕表明，MCP-1-2518位點攜帶G等位基因者血清MCP-1水平顯著增高，且增加AMI的易感性。但MCP-1-2518G/A多態性對不同種族人群血清MCP-1水平和心肌梗死的影響并不一致〔6，7〕。本研究旨在探索中國蘇南地區漢族人群的MCP-1-2518G/A多態性、血清MCP-1水平和UAP三者之間的相關性。

1 對象與方法

1.1 研究對象 所有研究對象均為2005年6月至2010年6月期間在江蘇大學附屬武進醫院心內科的住院病人。(1)MCP-1-2518G/A多態性檢測對象:UAP組:符合2002年AHA/ACC關于ACS診斷標準的UAP患者(UAP組)203例，男139例，女64例，年齡 36～87〔平均(64.82±11.09)〕歲;同期住院并經冠脈造影檢查證實無冠脈病變者(對照組)192例，男95例，女97例，年齡30～76〔平均(56.93±10.12)〕歲。(2)血清MCP-1水平檢測對象:從以上研究對象中隨機選擇UAP患者(UAP組)72例，男50例，女22例，年齡36～85〔平均(63.74±10.67)〕歲;無冠脈病變者(對照組)73例，男38例，女35例，年齡30～76〔平均(59.04±12.13)〕歲。所有研究對象排除嚴重肝腎功能不全、腫瘤、風濕類疾病和急性或嚴重慢性感染者。該研究經本院醫學倫理委員會批準，并征得所有入選對象知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 一般資料采集 收集所有入選對象的基本資料，包括年齡、性別、吸煙史、高血壓史、糖尿病史、血脂和冠狀動脈造影等結果。

1.2.2 MCP-1-2518G/A多態性檢測 采集靜脈血2 ml，采用標準的酚-氯仿法提取外周白細胞基因組DNA，置于－70℃冰箱保存備用。采用PCR-RFLP方法檢測MCP-1-2518位點基因型。上游引物:5'-TCT CTC ACG CCA GCA CTG ACC-3'，下游引物:5'-GAG TGT TCA CAT AGG CTT CTG-3'(引物由大連寶生物公司合成)。擴增條件:95℃預變性5 min，然后以95℃40 s、60℃ 30 s和72℃ 40 s共行30個循環，最后 72℃延伸10 min;擴增結束后，取4 μl PCR擴增產物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳10 min，確定PCR產物為所需要的目的片段(234 bp)。對目的片段行限制性酶切:(1)酶切反應體系:PCR產物10 μl、PvuⅡ內切酶1 μl(由大連寶生物公司提供)、緩沖液2 μl和去離子水7 μl;(2)酶切反應條件:37℃水浴過夜;(3)基因分型:取酶切產物10 μl加6 ×loading 1.5 μl，在含膠紅染料的 2%瓊脂糖凝膠中電泳30 min，然后在紫外線凝膠成像儀中觀察結果并分析。

1.2.3 血清MCP-1水平測定 取入選者靜脈血2 ml，室溫下靜置0.5～1 h，離心后留取上層血清，－70℃冰箱保存待測。采用ELISA法隨機檢測了72例UAP患者和73例對照者的血清MCP-1含量。試劑盒購自ADL公司，操作步驟按試劑盒說明書進行。

1.2.4 血脂測定 在自動生化分析儀上檢測血清甘油三酯(TG)，總膽固醇(TC)，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)。

1.3 統計學分析 采用SPSS 17.0軟件進行統計分析。數值變量以±s表示;分類變量以百分比(%)表示。血清MCP-1水平在組內基因型間比較采用單因素方差分析、基因型間兩兩比較采用LSD檢驗，其他數值變量組間比較采用t檢驗;分類變量組間比較采用χ2檢驗。相關性分析采用多元線性回歸分析。MCP-1-2518位點基因型及血清MCP-1水平與UAP發病風險相關性分析采用多變量Logistic回歸分析。

2 結果

2.1 UAP組與對照組的臨床資料比較 與對照組相比，UAP組中高血壓，糖尿病及吸煙者所占比例及血清TG、TC和LDL-C水平明顯增高(P＜0.001;P＜0.01)。見表1。

2.2 UAP組與對照組的MCP-1-2518G/A多態性分析 MCP-1 A-2518G多態性PCR產物經酶切后電泳顯示GG(159 bp和75 bp)、GA(234 bp、159 bp和75 bp)和 AA(234 bp)三種基因型(圖1)。本研究人群經χ2檢驗符合Hardy-Weinberg遺傳平衡規律(P＞0.05)，具有群體代表性。與對照組比較，UAP組AA基因型頻率較高，G等位基因頻率低于對照組(P=0.044);多變量(多因素包括年齡，性別，吸煙，高血壓病，糖尿病及血脂異常)Logistic回歸分析發現MCP-1-2518G/A多態性不增加UAP易感性。見表2。

表1 UAP組與對照組的臨床資料比較

表2 UAP組與對照組的MCP-1-2518G/A多態性分布〔n(%)〕

2.3 UAP組與對照組的血清MCP-1水平比較 血清MCP-1水平在 UAP組〔(286.23±284.20)pg/ml〕顯著高于對照組〔(172.61 ±178.70)pg/ml〕(P=0.005)。

圖1 MCP-1 2518G/A多態性PCR產物酶切電泳圖

2.4 血清MCP-1水平的影響因素 多元線性回歸分析賦值為:基因型:AA型=0，GA+GG型 =1;年齡:＜60歲 =0，≥60歲=1;性別:女性=0，男性=1;高血壓史:無=0，有=1;糖尿病史:無=0，有=1;吸煙:不吸煙=0，吸煙=1;血脂水平:正常為0，不正常=1。結果顯示，血清 MCP-1水平與下列因素相關(P＜0.001，R2=0.429):與高血壓、糖尿病和吸煙呈正相關，與男性呈負相關。見表3。

2.5 MCP-1-2518G/A多態性對血清MCP-1水平的影響 血清MCP-1水平在UAP組和對照組組內任何基因型之間皆無顯著差異。見表4。

表3 血清MCP-1水平的影響因素

表4 血清MCP-1水平在UAP組和對照組組內基因型間比較

2.6 血清MCP-1水平與UAP發病風險的相關性 多變量(包括年齡:＜45歲=1、45～54歲 =2、55～64歲 =3、≥65歲 =4;血清MCP-1水平:＜302.23 pg/ml=0、≥302.23 pg/ml=1;性別、吸煙、高血壓、糖尿病和血脂水平賦值標準同上)Logistic回歸分析揭示≥75%分位數的血清MCP-1水平(302.23 pg/ml)是UAP發病的獨立危險因素〔OR(95%CI):2.904(1.058～7.970)，P=0.039〕。

3 討論

目前認為UAP與多種環境因素和遺傳因素有關，炎癥和免疫反應在其發病過程中發揮重要作用。MCP-1通過招募和活化單核細胞進入血管壁而影響動脈粥樣硬化的發展〔8〕。在一些非人靈長類的動脈粥樣硬化的動物模型中阻斷MCP-1的作用不僅導致動脈粥樣硬化斑塊面積明顯縮小，還使得斑塊轉變成一種更穩定的類型〔9〕。在一些人類流行病學研究中發現ACS患者的血清MCP-1水平明顯高于正常人，并且高MCP-1血清水平與與 ACS 相關〔3，4〕。Brad〔10〕等發現 MCP-1 基因遠端調控區2518G/A多態性影響MCP-1的轉錄活性。

本研究與捷克〔7〕和日本〔6〕人群的心肌梗死以及中國〔11〕人群的早發冠心病研究結果基本一致，即MCP-1-2518G/A多態性與心肌梗死/早發冠心病的發病風險無關;但不支持弗明翰地區人群攜帶MCP-1-2518G/A G等位基因者的心肌梗死發病風險增高〔5〕以及斯洛伐克人群MCP-1-2518G/A多態性與缺血性心臟病和早發心肌梗死存在相關性〔12〕的結論。這種差異可能與下列因素有關:(1)研究人群的遺傳背景不同:捷克、日本和中國人群中 MCP-1-2518位點 G 等位基因頻率約60%〔6，7，11〕，而弗明翰、斯洛伐克地區人群中MCP-1-2518位點G等位基因頻率約30%〔5，12〕;(2)對照組的入選標準不同:本文對照組是經冠脈造影排除冠脈病變者;(3)研究樣本量大小不同:本研究和斯洛伐克人群研究的樣本量遠小于弗明翰人群研究。

本研究發現MCP-1-2518G/A多態性不影響其血清MCP-1水平，驗證了中國早發冠心病〔11〕以及捷克〔7〕和日本〔6〕人群的心肌梗死患者MCP-1-2518G/A多態性不影響血清MCP-1水平的結論，但不支持弗明翰地區人群攜帶MCP-1-2518G/A G等位基因者血清MCP-1水平顯著增高的研究結果〔5〕。上述研究結果的差異很可能與不同種族人群的MCP-1-2518G/A多態性不同及其對血清MCP-1水平的影響不同、所入選對象不同有關。

本研究所顯示UAP患者血清MCP-1水平明顯升高的結果與既往報道〔3～5，12〕基本一致，≥75%分位數的血清 MCP-1水平與UAP發病風險相關的現象與de Lemos〔3〕等研究結果基本相符。而且，筆者還驗證了 Iwai〔6〕和 de Lemos〔3〕等所報道的研究結果，即血清MCP-1水平受到高血壓、糖尿病、吸煙和性別等冠心病傳統危險因素的影響。因此，盡管UAP患者血清MCP-1水平顯著升高以及≥75%分位數的血清MCP-1水平與UAP發病風險相關，但由于血清MCP-1水平受多種臨床因素的影響，且在UAP組和對照組分布明顯重疊，從而限制了其在預測、診斷UAP中的應用。

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