不穩(wěn)定型心絞痛患者M(jìn)CP-1-2518G/A多態(tài)性和血清單核細(xì)胞趨化蛋白水平的相關(guān)性

何國平 姜 九 師干偉 許聯(lián)紅 戚傳平 (江蘇大學(xué)附屬武進(jìn)醫(yī)院心血管內(nèi)科，江蘇 常州 23002)

不穩(wěn)定型心絞痛(UAP)是嚴(yán)重危害人類健康的主要疾病之一，炎癥反應(yīng)在其發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用〔1〕。單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)能誘導(dǎo)斑塊內(nèi)細(xì)胞表達(dá)某些炎癥因子、基質(zhì)金屬蛋白酶和組織因子等使原來穩(wěn)定的斑塊變成易損斑塊并發(fā)生破裂和繼發(fā)血栓形成而導(dǎo)致急性冠脈綜合征(ACS)的發(fā)生〔2〕。流行病學(xué)研究表明，血清MCP-1水平與ACS密切相關(guān)，且血清MCP-1水平明顯升高的ACS患者預(yù)后差〔3，4〕。弗明翰心臟病中心的研究〔5〕表明，MCP-1-2518位點(diǎn)攜帶G等位基因者血清MCP-1水平顯著增高，且增加AMI的易感性。但MCP-1-2518G/A多態(tài)性對不同種族人群血清MCP-1水平和心肌梗死的影響并不一致〔6，7〕。本研究旨在探索中國蘇南地區(qū)漢族人群的MCP-1-2518G/A多態(tài)性、血清MCP-1水平和UAP三者之間的相關(guān)性。

1 對象與方法

1.1 研究對象 所有研究對象均為2005年6月至2010年6月期間在江蘇大學(xué)附屬武進(jìn)醫(yī)院心內(nèi)科的住院病人。(1)MCP-1-2518G/A多態(tài)性檢測對象:UAP組:符合2002年AHA/ACC關(guān)于ACS診斷標(biāo)準(zhǔn)的UAP患者(UAP組)203例，男139例，女64例，年齡 36～87〔平均(64.82±11.09)〕歲;同期住院并經(jīng)冠脈造影檢查證實(shí)無冠脈病變者(對照組)192例，男95例，女97例，年齡30～76〔平均(56.93±10.12)〕歲。(2)血清MCP-1水平檢測對象:從以上研究對象中隨機(jī)選擇UAP患者(UAP組)72例，男50例，女22例，年齡36～85〔平均(63.74±10.67)〕歲;無冠脈病變者(對照組)73例，男38例，女35例，年齡30～76〔平均(59.04±12.13)〕歲。所有研究對象排除嚴(yán)重肝腎功能不全、腫瘤、風(fēng)濕類疾病和急性或嚴(yán)重慢性感染者。該研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，并征得所有入選對象知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 一般資料采集 收集所有入選對象的基本資料，包括年齡、性別、吸煙史、高血壓史、糖尿病史、血脂和冠狀動脈造影等結(jié)果。

1.2.2 MCP-1-2518G/A多態(tài)性檢測 采集靜脈血2 ml，采用標(biāo)準(zhǔn)的酚-氯仿法提取外周白細(xì)胞基因組DNA，置于－70℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用PCR-RFLP方法檢測MCP-1-2518位點(diǎn)基因型。上游引物:5'-TCT CTC ACG CCA GCA CTG ACC-3'，下游引物:5'-GAG TGT TCA CAT AGG CTT CTG-3'(引物由大連寶生物公司合成)。擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性5 min，然后以95℃40 s、60℃ 30 s和72℃ 40 s共行30個(gè)循環(huán)，最后 72℃延伸10 min;擴(kuò)增結(jié)束后，取4 μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳10 min，確定PCR產(chǎn)物為所需要的目的片段(234 bp)。對目的片段行限制性酶切:(1)酶切反應(yīng)體系:PCR產(chǎn)物10 μl、PvuⅡ內(nèi)切酶1 μl(由大連寶生物公司提供)、緩沖液2 μl和去離子水7 μl;(2)酶切反應(yīng)條件:37℃水浴過夜;(3)基因分型:取酶切產(chǎn)物10 μl加6 ×loading 1.5 μl，在含膠紅染料的 2%瓊脂糖凝膠中電泳30 min，然后在紫外線凝膠成像儀中觀察結(jié)果并分析。

1.2.3 血清MCP-1水平測定 取入選者靜脈血2 ml，室溫下靜置0.5～1 h，離心后留取上層血清，－70℃冰箱保存待測。采用ELISA法隨機(jī)檢測了72例UAP患者和73例對照者的血清MCP-1含量。試劑盒購自ADL公司，操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.4 血脂測定 在自動生化分析儀上檢測血清甘油三酯(TG)，總膽固醇(TC)，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)值變量以±s表示;分類變量以百分比(%)表示。血清MCP-1水平在組內(nèi)基因型間比較采用單因素方差分析、基因型間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，其他數(shù)值變量組間比較采用t檢驗(yàn);分類變量組間比較采用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用多元線性回歸分析。MCP-1-2518位點(diǎn)基因型及血清MCP-1水平與UAP發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性分析采用多變量Logistic回歸分析。

2 結(jié)果

2.1 UAP組與對照組的臨床資料比較 與對照組相比，UAP組中高血壓，糖尿病及吸煙者所占比例及血清TG、TC和LDL-C水平明顯增高(P＜0.001;P＜0.01)。見表1。

2.2 UAP組與對照組的MCP-1-2518G/A多態(tài)性分析 MCP-1 A-2518G多態(tài)性PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切后電泳顯示GG(159 bp和75 bp)、GA(234 bp、159 bp和75 bp)和 AA(234 bp)三種基因型(圖1)。本研究人群經(jīng)χ2檢驗(yàn)符合Hardy-Weinberg遺傳平衡規(guī)律(P＞0.05)，具有群體代表性。與對照組比較，UAP組AA基因型頻率較高，G等位基因頻率低于對照組(P=0.044);多變量(多因素包括年齡，性別，吸煙，高血壓病，糖尿病及血脂異常)Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)MCP-1-2518G/A多態(tài)性不增加UAP易感性。見表2。

表1 UAP組與對照組的臨床資料比較

表2 UAP組與對照組的MCP-1-2518G/A多態(tài)性分布〔n(%)〕

2.3 UAP組與對照組的血清MCP-1水平比較 血清MCP-1水平在 UAP組〔(286.23±284.20)pg/ml〕顯著高于對照組〔(172.61 ±178.70)pg/ml〕(P=0.005)。

圖1 MCP-1 2518G/A多態(tài)性PCR產(chǎn)物酶切電泳圖

2.4 血清MCP-1水平的影響因素 多元線性回歸分析賦值為:基因型:AA型=0，GA+GG型 =1;年齡:＜60歲 =0，≥60歲=1;性別:女性=0，男性=1;高血壓史:無=0，有=1;糖尿病史:無=0，有=1;吸煙:不吸煙=0，吸煙=1;血脂水平:正常為0，不正常=1。結(jié)果顯示，血清 MCP-1水平與下列因素相關(guān)(P＜0.001，R2=0.429):與高血壓、糖尿病和吸煙呈正相關(guān)，與男性呈負(fù)相關(guān)。見表3。

2.5 MCP-1-2518G/A多態(tài)性對血清MCP-1水平的影響 血清MCP-1水平在UAP組和對照組組內(nèi)任何基因型之間皆無顯著差異。見表4。

表3 血清MCP-1水平的影響因素

表4 血清MCP-1水平在UAP組和對照組組內(nèi)基因型間比較

2.6 血清MCP-1水平與UAP發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性 多變量(包括年齡:＜45歲=1、45～54歲 =2、55～64歲 =3、≥65歲 =4;血清MCP-1水平:＜302.23 pg/ml=0、≥302.23 pg/ml=1;性別、吸煙、高血壓、糖尿病和血脂水平賦值標(biāo)準(zhǔn)同上)Logistic回歸分析揭示≥75%分位數(shù)的血清MCP-1水平(302.23 pg/ml)是UAP發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素〔OR(95%CI):2.904(1.058～7.970)，P=0.039〕。

3 討論

目前認(rèn)為UAP與多種環(huán)境因素和遺傳因素有關(guān)，炎癥和免疫反應(yīng)在其發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。MCP-1通過招募和活化單核細(xì)胞進(jìn)入血管壁而影響動脈粥樣硬化的發(fā)展〔8〕。在一些非人靈長類的動脈粥樣硬化的動物模型中阻斷MCP-1的作用不僅導(dǎo)致動脈粥樣硬化斑塊面積明顯縮小，還使得斑塊轉(zhuǎn)變成一種更穩(wěn)定的類型〔9〕。在一些人類流行病學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)ACS患者的血清MCP-1水平明顯高于正常人，并且高M(jìn)CP-1血清水平與與 ACS 相關(guān)〔3，4〕。Brad〔10〕等發(fā)現(xiàn) MCP-1 基因遠(yuǎn)端調(diào)控區(qū)2518G/A多態(tài)性影響MCP-1的轉(zhuǎn)錄活性。

本研究與捷克〔7〕和日本〔6〕人群的心肌梗死以及中國〔11〕人群的早發(fā)冠心病研究結(jié)果基本一致，即MCP-1-2518G/A多態(tài)性與心肌梗死/早發(fā)冠心病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無關(guān);但不支持弗明翰地區(qū)人群攜帶MCP-1-2518G/A G等位基因者的心肌梗死發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增高〔5〕以及斯洛伐克人群MCP-1-2518G/A多態(tài)性與缺血性心臟病和早發(fā)心肌梗死存在相關(guān)性〔12〕的結(jié)論。這種差異可能與下列因素有關(guān):(1)研究人群的遺傳背景不同:捷克、日本和中國人群中 MCP-1-2518位點(diǎn) G 等位基因頻率約60%〔6，7，11〕，而弗明翰、斯洛伐克地區(qū)人群中MCP-1-2518位點(diǎn)G等位基因頻率約30%〔5，12〕;(2)對照組的入選標(biāo)準(zhǔn)不同:本文對照組是經(jīng)冠脈造影排除冠脈病變者;(3)研究樣本量大小不同:本研究和斯洛伐克人群研究的樣本量遠(yuǎn)小于弗明翰人群研究。

本研究發(fā)現(xiàn)MCP-1-2518G/A多態(tài)性不影響其血清MCP-1水平，驗(yàn)證了中國早發(fā)冠心病〔11〕以及捷克〔7〕和日本〔6〕人群的心肌梗死患者M(jìn)CP-1-2518G/A多態(tài)性不影響血清MCP-1水平的結(jié)論，但不支持弗明翰地區(qū)人群攜帶MCP-1-2518G/A G等位基因者血清MCP-1水平顯著增高的研究結(jié)果〔5〕。上述研究結(jié)果的差異很可能與不同種族人群的MCP-1-2518G/A多態(tài)性不同及其對血清MCP-1水平的影響不同、所入選對象不同有關(guān)。

本研究所顯示UAP患者血清MCP-1水平明顯升高的結(jié)果與既往報(bào)道〔3～5，12〕基本一致，≥75%分位數(shù)的血清 MCP-1水平與UAP發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的現(xiàn)象與de Lemos〔3〕等研究結(jié)果基本相符。而且，筆者還驗(yàn)證了 Iwai〔6〕和 de Lemos〔3〕等所報(bào)道的研究結(jié)果，即血清MCP-1水平受到高血壓、糖尿病、吸煙和性別等冠心病傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素的影響。因此，盡管UAP患者血清MCP-1水平顯著升高以及≥75%分位數(shù)的血清MCP-1水平與UAP發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，但由于血清MCP-1水平受多種臨床因素的影響，且在UAP組和對照組分布明顯重疊，從而限制了其在預(yù)測、診斷UAP中的應(yīng)用。

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