丹黃通絡膠囊對老年癡呆大鼠學習記憶能力及腦內膽堿能系統的影響

張小毅 李生瑩 潘國聘 詹合琴 (新鄉醫學院藥學院，河南 新鄉 453003)

阿爾茨海默病(AD)〔1，2〕，俗稱老年性癡呆，是多發于老年前期或老年期的一種以進行性智能減退為特征的中樞神經系統退行性疾病。隨著全球人口老齡化程度的加快，AD的發病率呈指數上升，嚴重威脅著老年人的健康和生活質量，已成為國內外醫學界的又一研究熱點。目前AD的病因、發病機制尚未完全清楚，缺乏有效的西醫治療措施，因此開發利用中藥復方，發揮中醫優勢來治療該病十分重要。本研究使用的中藥復方制劑丹黃通絡膠囊具有“活血化瘀、益氣通絡、滋補肝腎”等作用，對延緩衰老有較好療效，但其對AD是否有改善作用及機制尚不清楚，故本實驗采用側腦室內注射β淀粉多肽25～35片段(Aβ25～35)建立AD大鼠模型，觀察不同劑量丹黃通絡膽囊對AD模型大鼠學習記憶能力及腦內膽堿能系統的影響，進而探討其作用及機制，為臨床應用提供理論支持。注射Aβ25～35建立AD大鼠模型，觀察不同劑量丹黃通絡膠囊對AD模型大鼠學習記憶能力及腦內膽堿能系統的影響，進而探討其作用及機制為臨床應用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 5月齡健康Wistar大鼠，雌雄各半，體重250～260 g，由貴陽醫學院實驗動物中心提供，合格證號:SCXK(黔)2002-0001。

1.1.2 藥品與主要試劑 丹黃通絡膠囊:0.48 g/粒，含原生藥1.6 g/粒，批號:050526，貴陽天陽生物技術開發有限公司;β淀粉樣蛋白:Aβ25～35，批號:114k4773，Sigma 公司;膽堿乙酰轉移酶(ChAT)檢測試劑盒及乙酰膽堿酯酶(AchE)檢測試劑盒:南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物篩選、分組 適應性喂養1 w后，取Wistar大鼠進行Morris水迷宮訓練，淘汰掉學習成績太好(逃避潛伏期≤5 s)和太差(逃避潛伏期≥40 s)者，其余納為合格大鼠。將篩選合格的50只大鼠按訓練成績及性別均衡隨機分為正常對照組、AD模型組、丹黃通絡膠囊低、中、高劑量組(0.16，0.32，0.64 g/kg)，每組10 只。

1.2.2 模型制備及給藥 各組大鼠經10%水合氯醛腹腔注射麻醉后固定于大鼠腦立體定位儀上，預定側腦室注射進針坐標為:AP-1.3 mm(前囟后)，ML-1.8 mm(中線左側)，H-3.9 mm(自顱骨表面起的深度)。定位后鉆開顱骨，微量注射器垂直進針3.9 mm，AD模型組及給藥組于側腦室緩慢注入2 μl聚集態Aβ25～35，留針5 min，縫合傷口。正常對照組注入等體積無菌生理鹽水。術后次日丹黃通絡膠囊低、中、高劑量組開始按既定劑量灌胃給藥，每日1次，連續20 d，正常對照組及AD模型組均給予等容量蒸餾水。

1.2.3 Morris水迷宮測試AD大鼠學習記憶能力 各組大鼠在藥物干預結束后開始水迷宮檢測。①定位航行實驗:每天分上、下午兩個時間段，每個時間段訓練2次，分別從4個不同的標記點將大鼠面向池壁放入水中，記錄120 s內尋找平臺所需時間(逃避潛伏期)，每次訓練間隔60 s，共歷時5 d。如果大鼠在120 s內仍未找到平臺，則將其置于平臺上并停留10 s，潛伏期記為120 s。②空間探索實驗:于定位航行實驗結束的第2天進行。撤除平臺，任選1個入水點將大鼠面向池壁放入水中，記錄120 s內大鼠在平臺象限的游泳時間及在平臺象限游泳距離占總游程的百分比。

1.2.4 腦組織中ChAT、AchE活力的測定 行為學測試完成后迅速處死大鼠，在冰盤上斷頭取腦，將右側腦組織用冰生理鹽水沖洗，除去血液，濾紙吸干，電子天平稱重。在冰浴下用玻璃勻漿器制備10%的腦組織勻漿，用比色法測定腦組織中ChAT、AchE的活力，所有操作嚴格按照南京建成生物工程研究所試劑盒說明書進行。

1.2.5 免疫組化法檢測海馬神經元M1受體的表達 將左側腦組織置于4%多聚甲醛中固定24 h，常規石蠟包埋，制成5 μm厚連續切片，行SABC免疫組化法染色。每個動物取3張切片，每張切片隨機取互不重疊的5個視野，在高倍鏡下(×400)采用Biomias99圖像分析系統檢測M1受體的平均灰度值(Mean Gradation，MG)。

2 結果

2.1 丹黃通絡膠囊對AD模型大鼠學習記憶能力的影響 造模前各組大鼠的Morris水迷宮實驗成績無顯著性差異，造模后與正常對照組比較，AD模型組大鼠逃避潛伏期明顯延長(P＜0.05)，在平臺象限停留的時間和在平臺象限游程占總游程的百分比較明顯降低(P＜0.05);表明AD模型成功，使用丹黃通絡膠囊灌胃后，與AD模型組大鼠相比較，給藥組大鼠逃避潛伏期明顯縮短，在平臺象限停留的時間和在平臺象限游程占總游程的百分比明顯增加(P＜0.05)。見表1。

2.2 丹黃通絡膠囊對AD模型大鼠腦組織中ChAT、AchE活力的影響 與正常對照組比較，AD模型組大鼠腦組織中ChAT活力明顯降低，同時AchE活力顯著增強，差異具有統計學意義(P＜0.01);與AD模型組比較，丹黃通絡膠囊各劑量組ChAT活力均升高，AChE活力均下降，差異具有統計學意義(P＜0.01)，且具有一定的量效關系。見表2。

2.3 丹黃通絡膠囊對海馬神經元M1受體表達的影響 與正常對照組比較，AD模型組大鼠海馬神經元胞膜染色變淺，平均灰度值明顯增大，差異具有統計學意義(P＜0.01);與AD模型組比較，丹黃通絡膠囊低、中、高劑量組海馬神經元胞膜黃染不同程度加深，平均灰度值逐漸降低，呈劑量依賴性，且中、高劑量組差異具有統計學意義(P＜0.05，P＜0.01)。見表2，圖1。

表1 各實驗組大鼠水迷宮實驗結果(±s，n=10)

表1 各實驗組大鼠水迷宮實驗結果(±s，n=10)

與正常對照組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與AD模型組比較:3)P ＜0.05，4)P ＜0.01;下表同

組別 潛伏期(s)平臺象限停留時間(s)平臺象限游程/總游程(%)6.07±1.46 52.17±12.76 49.93±3.98 AD模型組 16.98±7.871)32.31±8.971)30.95±4.031)丹黃通絡膠囊低劑量組 12.55±7.76 40.47±10.57 37.54±6.15丹黃通絡膠囊中劑量組 8.01±3.313) 39.56±6.99 42.78±9.613)丹黃通絡膠囊高劑量組 5.61±2.793)47.23±8.973)50.32±8.043)正常對照組

表2 各實驗組大鼠ChAT、AchE活力及M1受體的表達(±s，n=10)

表2 各實驗組大鼠ChAT、AchE活力及M1受體的表達(±s，n=10)

257.45±31.09 0.43±0.05 161.53±12.25 AD模型組 156.74±19.562) 1.12±0.292) 185.90±11.352)丹黃通絡膠囊低劑量組 196.76±35.80 0.32±0.054) 150.42±26.22丹黃通絡膠囊中劑量組 206.80±21.134) 0.22±0.044) 142.78±8.323)丹黃通絡膠囊高劑量組 259.81±27.784) 0.21±0.054) 98.89±10.654)平均灰度值正常對照組組別 ChAT(U/g) AchE(U/mgprot)

圖1 各實驗組大鼠海馬神經元M1受體的表達(×400)

3 討論

隨著全世界人口的老齡化，AD已經成為威脅人類晚年生活質量的主要疾病之一，其發病率呈逐年上升的趨勢。AD是一種以進行性認知障礙和記憶力損害為主的中樞神經系統變性疾病，患者在疾病早期就出現智力和記憶力衰退，并可波及記憶的全過程。由于至今AD的發病機制仍不清楚，但可以肯定的是AD的病因是多方面的，因此，單一靶點的藥物很難取得滿意療效，大量的研究資料表明〔3～5〕，中藥治療疾病具有多靶點的特點，在發掘治療AD的新藥方面具有廣闊的前景。本研究所使用的丹黃通絡膠囊就是一種中藥的復方制劑，由丹參、黃芪、銀杏葉等五味中藥組成。丹參是常用的活血化淤中藥，黃芪是益氣之品，銀杏葉具有擴張血管、降低血液黏稠度、清除自由基、抗缺氧等功效，因而，丹黃通絡膠囊具有“活血化瘀、益氣通絡、滋補肝腎”等作用，對于“腎虛精虧、瘀血阻絡”的AD發病機制可進行多靶點針對性治療。本實驗結果也顯示，使用丹黃通絡膠囊治療后，AD大鼠逃避潛伏期縮短，在平臺象限停留的時間和在平臺象限游程占總游程的百分比增加，這都說明丹黃通絡膠囊能夠改善AD模型大鼠的空間學習和記憶能力。

中樞膽堿能系統與學習記憶功能密切相關，主要通過膈區-海馬-邊緣葉和大腦皮質兩條通路特異性調節第一級記憶轉入第二級記憶的過程〔6〕。乙酰膽堿是其中的重要神經遞質之一，它由膽堿和乙酰輔酶A在ChAT的催化下合成，以囊泡泡吐形式進入突觸間隙，進而作用于突觸后膜的Ach受體，介導信息的傳遞，參與學習記憶功能的完成，之后就被AchE迅速水解〔7〕。在此過程中，ChAT和AchE是調節腦內ACh含量的兩個關鍵酶，其活性變化可間接反映腦內Ach的代謝情況。其中ChAT在膽堿能神經元胞體內合成，其在中樞神經系統內的分布與Ach平行，故常作為膽堿能神經的標志酶，是估計Ach含量的間接指標〔8〕。早在70年代Deutsch等在實驗中發現動物注射擬膽堿藥能增進學習記憶能力，而注射抗膽堿藥則可以減弱學習記憶能力〔9〕。大量臨床研究也顯示〔10，11〕，AD 患者均有不同程度的ChAT、AchE和Ach合成、釋放、攝取等功能障礙，并伴有膽堿能神經元的變性和缺失。隨著衰老病程的進展，患者大腦皮質、基底前腦及海馬等部位的膽堿能神經元的數目和ChAT的活性明顯下降，并與癡呆的嚴重程度密切相關。本實驗結果表明，丹黃通絡膠囊不僅能夠降低AchE的活性，增強ChAT的活性，而且能夠提高海馬神經元細胞膜上M1受體表達，從而增加腦內Ach的含量，對膽堿能系統有明顯的調節作用，代償AD發病過程中膽堿能神經元的丟失和Ach含量的減少，這可能是丹黃通絡膠囊改善學習記憶功能的機制之一。

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