丹參酮ⅡA對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化大鼠VCAM-1表達(dá)的影響

黎洪展 呂永恒 陳 琪 黃光勝 (南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，廣東 廣州 510315)

目前研究認(rèn)為動(dòng)脈粥樣硬化(AS)過(guò)程不僅僅是脂質(zhì)在動(dòng)脈壁中的聚積，而且是一種慢性炎癥性疾病，多種炎性細(xì)胞因子的過(guò)度釋放是形成的重要步驟已經(jīng)被廣泛接受〔1〕。近幾年研究發(fā)現(xiàn)作為黏附分子家族中的重要一員血管細(xì)胞黏附分子-1(VCAM-1)參與了AS的形成過(guò)程〔2〕，丹參酮ⅡA(TanshinoneⅡA，Tsn)具有逆轉(zhuǎn)AS的作用〔3〕。本研究旨在探討Tsn對(duì)試驗(yàn)性大鼠AS形成及主動(dòng)脈VCAM-1表達(dá)的影響，為AS的防治及丹參類(lèi)中藥的臨床應(yīng)用提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組及給藥 健康SD雄性大鼠，30只，體質(zhì)量(180±10)kg。將大鼠隨機(jī)分為3組:正常對(duì)照組、模型組和Tsn組，每組10只。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)后，除正常對(duì)照組外，各組按50萬(wàn)IU/kg的總劑量灌胃給予維生素D3，分3 d給完，正常對(duì)照組，僅飼以普通柱狀大鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料;其余各組進(jìn)食高脂飼料:大鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料83%，膽固醇2%，豬油10%，白砂糖5%，每天每只給予15 g高脂飼料，期間全部自由飲水。給予高脂飼料4 d后，開(kāi)始灌服丹參酮ⅡA每日10 mg/kg灌服，空白組和模型組每天灌服雙蒸餾水5 ml/kg，12 w后實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑和儀器 丹參酮ⅡA(純度85%)購(gòu)自上海第一生物化學(xué)藥業(yè)有限公司;VCAM-1單克隆抗體(1∶100)，購(gòu)自武漢博士德生物工程公司。即用型SABC免疫組化試劑盒(含生物素標(biāo)記山羊抗兔/大鼠IgG二抗和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉菌卵白素工作液)和DAB顯色試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;蘇丹Ⅲ為天津市大茂化學(xué)試劑廠產(chǎn)品;荷蘭威圖全自動(dòng)生化分析儀;LeicaRM2125切片機(jī)和LeicaDME321058943PX顯微攝像機(jī)由德國(guó)徠卡公司生產(chǎn);OLYMPUS CH20BIMF200-2顯微鏡由日本奧林巴斯公司生產(chǎn)。

1.3 方法

1.3.1 血脂測(cè)定 第12周末從眼眶取血，取血前禁食12 h，離心，取血清，在自動(dòng)化生化儀上測(cè)定血清總膽固醇(TC)、血清甘油三酯(TG)、血清低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)。

1.3.2 主動(dòng)脈病變病理檢查 試驗(yàn)結(jié)束后，予0.6 ml/kg速眠新后肢外側(cè)肌肉注射麻醉大鼠，于無(wú)菌條件下迅速取出主動(dòng)脈，剝凈外膜和周?chē)荆乇硞?cè)正中線縱向剪開(kāi)，用0.9%生理鹽水沖洗干凈，平鋪于濾紙上，用15%中性甲醛固定。蘇丹Ⅲ染色，用500萬(wàn)像素的數(shù)碼照相機(jī)近距離照相，采用全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)(Penguin2600CL DX51TR美國(guó))計(jì)算管腔面積、新生內(nèi)膜面積及內(nèi)膜增生百分比。HE染色，在顯微鏡下觀察主動(dòng)脈的壁厚度、內(nèi)膜泡沫細(xì)胞的含量、內(nèi)膜炎癥、內(nèi)膜脂質(zhì)沉積程度的變化。

1.3.3 主動(dòng)脈VCAM-1免疫組織化學(xué)染色 在胸主動(dòng)脈中段定位切取2 mm×5 mm組織，制石蠟切片，PBS洗3次，每次3 min，按免疫組化試劑盒說(shuō)明進(jìn)行免疫組化染色，在顯微鏡高倍視野下觀察分析陽(yáng)性結(jié)果，采用圖像分析系統(tǒng)，以陽(yáng)性表達(dá)的百分率半定量分析VCAM-1表達(dá)的強(qiáng)弱。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件，結(jié)果以±s表示，組間差異采用單向方差分析(One-way ANOVA)。

2 結(jié)果

2.1 血脂檢查結(jié)果 高脂飲食組、高脂飲食加丹參酮高、中、低劑量組TC、TG、LDL-C水平較對(duì)照組顯著升高(P＜0.01)。高脂飲食組與Tsn組血清TC、TG、LDL-C水平差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 主動(dòng)脈病理學(xué)改變 肉眼可見(jiàn)對(duì)照組內(nèi)膜光滑，無(wú)斑塊形成。高脂模型組血管表面不光滑，凹凸不平，大量黃白色斑塊突出于管腔表面，并連接成片，尤以近主動(dòng)脈弓處及血管開(kāi)口處最為明顯。HE染色可見(jiàn)模型組的內(nèi)膜顯著增厚，內(nèi)膜不完整，內(nèi)皮下腔隙增大，內(nèi)含大量泡沫細(xì)胞，中彈力纖維增粗，彈力纖維和膠原纖維排列紊亂。組主動(dòng)脈內(nèi)膜厚度較模型組顯著變薄，病理改變減輕，只偶有少量的脂質(zhì)沉積、散在的泡沫細(xì)胞和炎癥細(xì)胞。與對(duì)照組相比，模型組管腔面積減小、新生內(nèi)膜面積增大、內(nèi)膜增生百分比增大(P＜0.001)。與模型組相比，Tsn組管腔面積增大、新生內(nèi)膜面積減小、內(nèi)膜增生百分比減小(P＜0.05)。見(jiàn)表2。

2.3 主動(dòng)脈VCAM-1免疫組化檢測(cè) VCAM-1在模型組的表達(dá)為(33.67±5.43)%，較對(duì)照組的(0.55±0.25)%明顯增高(P＜0.01)，VCAM-1在Tsn組的表達(dá)為(18.29±2.52)%，較模型組降低(P＜0.05)。見(jiàn)圖1。

表1 各組血脂檢測(cè)結(jié)果(mmol/L，±s)

表1 各組血脂檢測(cè)結(jié)果(mmol/L，±s)

與對(duì)照組比較:1)P＜0.01;與模型組比較:2)P＜0.05

TC TG LDL-C對(duì)照組組別 n 10 2.21±0.35 1.09±0.38 1.05±0.17模型組 10 28.29±0.871) 4.70±2.231) 9.32±0.291)Tsn組 10 22.54±1.431)2) 3.87±1.311)2) 8.52±0.511)2)

表2 各組主動(dòng)脈內(nèi)膜增生情況比較(±s)

表2 各組主動(dòng)脈內(nèi)膜增生情況比較(±s)

與對(duì)照組比較:1)P＜0.001;與模型組比較:2)P＜0.05

組別 n 管腔面積(×104μm2)新生內(nèi)膜面積(×104μm2)內(nèi)膜增生百分比(%)10 4.37±0.72 3.05±1.03 40.7±10.4模型組 10 2.56±0.251) 4.58±1.301) 63.2±7.41)Tsn組 10 3.96±0.452) 3.38±1.102) 45.2±8.92)對(duì)照組

圖1 主動(dòng)脈VCAM-1的表達(dá)(DAB，×200)

3 討論

AS是血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞受到血脂異常、高血壓及病毒感染等多種損傷性因素直接作用后，出現(xiàn)內(nèi)皮損傷，并導(dǎo)致過(guò)度炎癥性纖維增生性反應(yīng)的結(jié)局。血漿中 TC、TG、LDL過(guò)高都是AS的危險(xiǎn)因素。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠經(jīng)高脂飲食后，TC、TG、LDL-C顯著升高，主動(dòng)脈可見(jiàn)明顯AS斑塊形成，病理切片見(jiàn)血管內(nèi)皮下脂質(zhì)浸潤(rùn)等指標(biāo)，證明本實(shí)驗(yàn)AS模型已成功建立;Tsn不能降低大鼠血清TC、TG、LDL-C水平，但該組主動(dòng)脈內(nèi)膜脂質(zhì)斑塊面積較模型組有顯著性減少，病理切片顯示Tsn組主動(dòng)脈內(nèi)膜厚度較模型組顯著變薄，病理改變減輕，只偶有少量的脂質(zhì)沉積、散在的泡沫細(xì)胞和炎癥細(xì)胞，說(shuō)明Tsn能顯著、有效地抑制動(dòng)脈脂質(zhì)沉著，阻止AS形成。

VCAM-1是免疫球蛋白超基因家族，主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，已知正常動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞不表達(dá)VCAM-1，當(dāng)其受到炎癥介質(zhì)或其他刺激時(shí)才會(huì)表達(dá)。VCAM-1參與了AS發(fā)生、發(fā)展全過(guò)程。在高血脂刺激AS形成過(guò)程中，VCAM-1早期表達(dá)，促使白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的活動(dòng)性、黏附力和轉(zhuǎn)移力增強(qiáng)，使單核細(xì)胞黏附、遷移并轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞，攝取脂質(zhì)轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞，同時(shí)還可促進(jìn)T淋巴細(xì)胞及B淋巴細(xì)胞從血流中向內(nèi)皮細(xì)胞的黏附〔2，4〕。硬化晚期，VCAM-1參與了局部炎癥的激化、巨噬細(xì)胞的活化與聚集、分泌基質(zhì)金屬蛋白酶降解纖維帽的細(xì)胞外基質(zhì)成分等過(guò)程〔5〕。抑制VCAM-1的表達(dá)，可以減輕或延緩AS病變的發(fā)生和發(fā)展〔6〕。我們的研究發(fā)現(xiàn)，AS模型組主動(dòng)脈可見(jiàn)大量VCAM-1陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞，并且主要表達(dá)于病變血管的內(nèi)皮及斑塊中，而Tsn能明顯抑制AS大鼠主動(dòng)脈VCAM-1的表達(dá)，從而抑制了AS時(shí)炎癥細(xì)胞趨化、黏附與遷移，抑制AS時(shí)局部炎癥反應(yīng)而達(dá)到防治AS的作用。

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