電針改善血管性癡呆大鼠學習記憶及其與海馬神經細胞谷氨酸、NMDAR表達的關系

韋登明 賈學敏 尹向旭 蔣雯雯 (寧波大學醫學院病理教研室，浙江 寧波 315211)

針刺治療具有明顯改善血管性癡呆(VD)患者的癥狀和體征、增強其學習記憶能力的作用〔1〕，但具體的分子生物學機制還不十分清楚。已有實驗發現，學習和記憶的神經生物學基礎是突觸可塑性〔2〕，后者的理想模型是高頻刺激引起的長時程增強效應(LTP)，而谷氨酸激活N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDA)是誘導LTP產生的前提條件〔3〕。我們以往的研究表明〔4〕，電針大鼠百會、大椎穴能改善VD大鼠學習記憶能力，其機制可能與促進海馬LTP和增強海馬突觸可塑性有關。但電針改善VD大鼠學習記憶能力與海馬谷氨酸及其NMDA受體表達的關系如何?尚未見報道，本實驗在建立大鼠VD模型基礎上，通過檢測分析電針干預VD大鼠時對海馬谷氨酸及其NMDA受體表達變化影響，旨在探討電針對VD大鼠學習記憶影響的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 SD大鼠40只，購于浙江大學醫學院實驗動物中心提供，合格證號0102008。雌、雄不限，體重200～250 g，自由飲食。大鼠適應性喂養7 d后，分為正常對照組、假手術組、模型組、電針組，每組10只。

1.2 試劑儀器 G6805電針儀(上海華誼儀器制造廠生產);Morris水迷宮(北京新天地科技公司生產);兔抗大鼠谷氨酸、NMDA受體多克隆抗體、生物素化羊抗兔 IgG、SABC試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司);RY-2000瑞醫病理圖文分析系統(東南大學瑞醫科技產品)。

1.3 模型制備 模型組、電針組采用王蕊等〔5〕推薦的方法造模，將大鼠用10%的水合氯醛(3 ml/kg體重)麻醉后，仰臥位固定在手術臺上，常規消毒，頸正中切口，分離雙側頸總動脈;腹腔注射硝普鈉(3.5 mg/kg體重)后，隨即用無創動脈夾夾閉雙側頸總動脈，夾閉10 min再通10 min，再夾閉10 min，再通后縫合傷口，放回籠中保溫飼養。假手術組麻醉及手術過程同上，但不阻斷頸總動脈及注射硝普鈉。

1.4 電針干預方法 電針組大鼠術后第7天，手術切口基本愈合，飲食正常，開始給予電針治療。參照實驗針灸學〔6〕中大鼠的穴位定位方法取百會、大椎穴進針，用28號30 mm長毫針，于大鼠頭部百會穴(頂骨正中)斜刺1.5 mm，大椎穴(第7頸椎與第1胸椎間，背部正中)直刺1.5 mm，連接電針儀，采用連續波，頻率為50 Hz，強度以大鼠能耐受為度(約1 mA)，每天電針1次，留針20 min，連續治療10 d。

1.5 檢測方法

1.5.1 學習記憶行為學檢測 采用Morris水迷宮試驗，于電針治療結束時(即實驗第17天)進行檢測。①定位航行試驗:歷時6 d，每天2次，將大鼠固定從第一象限面向池壁放入水中，記錄其2 min內尋找平臺的時間，即逃避潛伏期(escape latency，EL)。逃避潛伏期越短提示大鼠學習記憶能力越強，反之則越差。②空間探索試驗:定位航行試驗結束后(即實驗第22天)撤除平臺，將大鼠固定從第一象限放入水中，測其2 min內跨越原平臺的次數及其在水迷宮外環停留時間。大鼠在相同時間內跨越原平臺的次數越多，學習記憶能力越強，反之則越差。由配套電腦系統自動記錄成績。

1.5.2 腦組織Glu、NMDA受體免疫組織化學染色觀察 電針治療結束后，用10%水合氯醛(3 ml/kg體重)麻醉大鼠，迅速開胸暴露心臟;經升主動脈插管后，先用100 ml生理鹽水快速沖洗，隨后用4%多聚甲醛磷酸緩沖液(pH7.4)灌注約1 h;灌注完畢后取海馬腦組織，用甲醛溶液固定24 h，石蠟包埋切片后行谷氨酸、NMDA受體免疫組織化學染色。

免疫組織化學染色主要步驟為:石蠟切片常規脫蠟至水，滴加0.3%H2O2在37℃下處理15 min;滴加10%正常羊血清在37℃下處理10 min，勿洗;滴加兔抗大鼠谷氨酸、NMDA受體多克隆抗體(1∶300、1∶400)在4℃下處理24 h;滴加生物素化羊抗兔IgG二抗(1∶100)在37℃下處理2 h;滴加SABC適量，在37℃下處理1 h;DAB顯色5～10 min;陰性對照實驗用磷酸鹽緩沖液代替一抗，其余步驟相同。每步之間用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH值7.4)洗3次，每次5 min。常規脫水、透明、封片。結果判斷:顯微鏡下海馬神經細胞胞漿呈棕色著色者為陽性細胞，用RY-2000瑞醫病理圖文分析系統進行計算其積分光密度。

2 結果

2.1 電針對大鼠空間學習記憶的影響 正常對照組、假手術組、電針組大鼠6 d平均逃避潛伏期明顯短于模型組(P＜0.01)，而正常對照組、假手術組和電針組之間的差異無統計學意義(P＞0.05)。正常對照組、假手術組、電針組大鼠在平臺象限跨越次數明顯多于模型組(P＜0.01)，而電針組、正常對照組、假手術組3組之間比較，差異均無統計學意義(P＞0.05)。表明未給予治療的模型大鼠學習記憶獲取能力較差，而電針治療則可改善模型大鼠的學習記憶能力。見表1。

2.2 電針對大鼠腦組織谷氨酸、NMDA受體表達的影響 正常對照組、假手術組大鼠海馬組織見少量谷氨酸、NMDA受體陽性細胞;模型組大鼠腦組織見很少谷氨酸、NMDA受體免疫染色陽性細胞，主要分布海馬神經細胞胞漿;應用電針治療后，大鼠腦組織谷氨酸、NMDA受體免疫染色陽性細胞積分光密度值較模型組明顯增加，與模型組比較差異有統計學意義(P＜0.01)。見表2。

表1 大鼠水迷宮學習記憶行為學檢測結果(±s，n=10)

表1 大鼠水迷宮學習記憶行為學檢測結果(±s，n=10)

與假手術組比較:1)P＜0.01;與模型組比較:2)P＜0.01

組別 逃避潛伏期(s) 平臺跨越次數(次)正常對照組33±4.96 7.13±1.06假手術組 34±5.65 6.95±1.18模型組 78±6.421) 1.52±1.371)電針組 41±4.362) 5.68±1.642)

表2 電針對大鼠腦海馬組織谷氨酸、NMDA受體表達的影響(±s，n=10)

表2 電針對大鼠腦海馬組織谷氨酸、NMDA受體表達的影響(±s，n=10)

與假手術組組比較:1)P＜0.05;與模型組比較:2)P＜0.05

受體積分光密度正常對照組組別 谷氨酸積分光密度 NMDA 61.2±3.4 47.4±2.9假手術組 56.4±4.2 45.3±3.6模型組 37.3±4.11) 28.2±3.91)電針組 52.7±4.72) 41.5±4.52)

3 討論

VD常由缺血性腦血管疾病引起。腦缺血易導致海馬發生損傷，海馬是學習和記憶的中樞，因此，VD表現為高級神經認知功能障礙為主的一組臨床綜合征。針刺治療血管性癡呆具有多通道、多靶點、多水平的調節和控制作用，電針作為一種傳統的非藥物治療手段，多年來在我國得到廣泛應用，而且在臨床老年性癡呆治療中有肯定的價值〔1，7～10〕。中醫學認為，VD病變在腦，督脈通于腦，百會、大椎皆屬督脈，百會為“三陽五會”，大椎為“諸陽之會”，針刺兩穴，可醒腦益智開竅、振奮陽氣，并達陽以生陰之功，可促進VD大鼠腦組織功能恢復〔8〕，故本實驗選穴以督脈之百會、大椎為治療穴。結果提示電針百會、大椎穴可改善VD大鼠學習記憶能力。

谷氨酸是中樞神經系統內的主要興奮性神經遞質，約50%的谷氨酸參與調節中樞神經系統內的突觸傳遞，幾乎可調節正常腦內的所有功能，包括學習、記憶、運動、認知和發育。海馬結構是學習記憶的重要區域，其神經元后膜有NMDAR，是興奮性氨基酸谷氨酸的一類特異性受體。谷氨酸受體可分為代謝型和離子型兩大類，離子型受體NMDAR被認為是突觸可塑性及皮質和海馬神經元LTP的主要調控者，構成了中樞神經系統的重要功能如學習和記憶的基礎。有研究證明:選擇性敲除小鼠海馬CA 1區錐體細胞的NR 1亞單位后，其NMDAR誘導的LTP被破壞，且小鼠表現為空間記憶障礙〔11〕。

本研究提示學習記憶能力下降可能與谷氨酸、NMDA受體表達減少致神經傳遞功能障礙有關。關于VD大鼠海馬神經谷氨酸、NMDA受體表達減少，我們推測可能與下列因素有關:在急性腦缺血缺氧等病理情況下，海馬結構等缺血易損區的谷氨酸大量釋放，激活了NMDAR，導致由NMDAR介導的Ca2+大量內流，Ca2+超載引發一系列的毒性反應，造成神經元損傷、脫失〔12〕，由于急性腦缺血時谷氨酸的過度釋放和耗竭，使其與NMDA受體的結合減少或NMDA受體失活;同時由于海馬神經元的數目減少和結構受損，導致NMDA受體數目減少。由于LTP的產生有賴于谷氨酸與其NMDA受體的結合〔3〕，海馬神經谷氨酸、NMDA受體表達減少，必然造成LTP損害，引起神經傳導功能障礙。電針治療后，電針組大鼠與模型組比較，谷氨酸、NMDA受體免疫陽性細胞積分光密度值顯著增大，提示電針大鼠百會、大椎穴可提高海馬神經谷氨酸、NMDA受體的表達。

我們已有的研究表明〔4〕;電針VD大鼠百會、大椎穴可提高海馬神經突觸密度，促進突觸結構的可塑性;并可促進海馬神經LTP，加快海馬神經元突觸傳遞過程。因此，結合本實驗結果，我們認為電針改善VD大鼠學習記憶能力的機制可能由于提高了海馬神經突觸密度，增加了海馬神經突觸的谷氨酸、NMDA受體表達的數量，從而促進促進海馬LTP來實現的。具體機制有待進一步研究加以證實。

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