吡格列酮配合生活干預對自發性高血壓大鼠AT1受體及mRNA的影響

陳海燕 李 杰 孫艷伏 唐文娟 王 贊 (吉林大學第一醫院干部病房，吉林 長春 130021)

原發性高血壓的發展與胰島素抵抗(IR)密切相關，糾正IR可以達到良好的降壓作用和心血管保護作用〔1，2〕。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(RAAS)功能亢進，特別是血管緊張素Ⅱ受體1(AT1R)功能亢進與高血壓的發生發展以及靶器官損害關系非常密切。本研究對自發性高血壓大鼠(SHR)應用吡格列酮(PIO)配合生活方式干預，檢測定心肌及主動脈組織AT1R和mRNA表達水平，探討PIO配合生活方式干預的降壓作用和心血管保護作用的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SHR大鼠33只，雄性，購自北京維通利華公司，鼠齡6～7 w，體重120～160 g，分為4～6只/籠飼養，室溫20℃ ～24℃，控制晝夜光照，避免過多噪聲及其他干擾。觀察期為1 w，實驗期為12 w。

1.2 分組及給藥方法 全部大鼠隨機分為三組，每組11只，觀察飼養1 w使大鼠適應環境。①SHR空白組(SHR)，給予鼠糧及清水。②硝苯地平(N)組，硝苯地平加入飲水中，濃度140 mg/L。③PIO配合生活干預組(P)，鹽酸吡格列酮(批號:H20050200，廠家:日本武田藥品工業株式會社)45 mg/L，加入飲水中，同時給予生活方式干預。

1.3 生活干預方法 ①飲食控制方法:實驗開始后，SHR組及N組大鼠不限制鼠糧及飲水，每周測量1次SHR組大鼠24 h進食量;計算平均進食量，P組每日清晨給予SHR組前一周每日平均進食量的90%;②游泳方法及條件:P組大鼠第1周游泳時間為6～8 min，第12周時可堅持到15 min，呈逐漸延長趨勢，同一時間在安靜條件下進行，以大鼠漂浮水面不動并出現頭部下沉為停止信號，水溫28℃ ～30℃，水深50 cm，保證大鼠不能觸及底部及側壁逃避運動。實驗期間大鼠無意外死亡。

1.4 原位雜交和免疫組化

1.4.1 標本采集及保存 乙醚麻醉后，沿正中線剪開大鼠胸腔，摘取心臟及主動脈組織，將其切成3 mm×3 mm標本。用10%中性緩沖甲醛固定24 h后酒精逐級脫水，浸蠟塊后作5 μm連續切片，備免疫組化和原位雜交之用。

1.4.2 原位雜交探針的制備 原位雜交探針購于武漢博士德生物工程有限公司。AT1R多相寡核苷酸探針的堿基序列為:①5'-CGAGC TCCCT CTGAG TCAGG AAACA TTTTC-3';②5'-CTGGC CCCTG TCATC TTCTG TCCCT TCCCA-3';③5'-TGAGC GCTTC GAGAT GTTCC GAGAG CTGAA-3'。

1.4.3 原位雜交 采用標記探針技術，按說明書操作(試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司)，DAB顯色。

1.4.4 免疫組化 采用抗生物素-生物素-過氧化物酶復合物法(ABC)，按說明書操作(試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司)，DAB顯色。

1.4.5 結果判定 在心肌細胞、血管壁細胞膜和胞質內出現棕褐色顆粒，且著色強度高于背景的特殊染色者判為陽性。應用LX70 Olympus顯微鏡 CooledCCD采集視野圖片，用計量分析系統(Image-Pro pius Analysis software)進行分析。

2 結果

2.1 大鼠心肌及主動脈AT1R免疫組化結果 各組大鼠心肌細胞質及主動脈內皮細胞中均可見AT1R陽性信號表達，以SHR組著色強度最深，呈棕黃色。通過染色密度掃描計算，N組著色強度略低于SHR組，差異沒有統計學意義(P＞0.05);P組大鼠心肌及主動脈組織AT1R表達均明顯低于SHR組及N組，差異具有統計學意義(P＜0.01)。見表1，圖1。

2.2 大鼠心肌及主動脈AT1原位雜交結果 大鼠心肌細胞質及主動脈內皮細胞均可見不同程度的AT1mRNA表達。通過染色密度掃描計算，P組大鼠心肌及主動脈組織AT1mRNA表達均明顯低于SHR組及N組，且差異具有統計學意義(P＜0.01)，N組大鼠心肌及主動脈組織AT1mRNA表達均略低于SHR組，差異無統計學意義(P＞0.05)。見表2，圖2。

表1 大鼠心肌和主動脈AT1R免疫組化灰度測定值(±s，n=11，%)

表1 大鼠心肌和主動脈AT1R免疫組化灰度測定值(±s，n=11，%)

與SHR組比較:1)P＜0.01;與N組比較:2)P＜0.01，下表同

組別 心肌 主動脈SHR組27.3±2.9 14.2±1.9 N組 25.6±2.7 13.9±1.8 P組 16.8±1.21)2) 6.5±0.71)2)

表2 大鼠心肌及主動脈AT1原位雜交灰度測定值(±s，n=11，%)

表2 大鼠心肌及主動脈AT1原位雜交灰度測定值(±s，n=11，%)

組別 心肌 主動脈SHR組24.3±2.4 12.3±1.5 N組 20.6±2.1 11.1±1.3 P組 10.4±1.21)2) 5.2±0.71)2)

圖1 各組大鼠心肌和主動脈AT1R免疫組化結果(DAB，×200)

圖2 各組大鼠心肌及主動脈AT1原位雜交檢測結果(DAB，×200)

3 討論

高血壓的發生、發展與IR關系密切，研究表明高血壓人群約60%伴有 IR〔3，4〕。本課題組曾用 PIO配合生活干預治療SHR，發現其有很好地降低SHR血壓、血脂作用，同時可以糾正或減低SHR心肌及主動脈內皮、內膜外脂質和血管平滑肌一些超微結構方面的改變，對高血壓所致靶器官損傷具有預防和緩解作用〔2，5，6〕。

高血壓所致各種靶器官損害均與組織重構、特別是血管重構關系密切，如果能夠逆轉或阻止血管重構即可以達到降低血壓和保護靶器官的作用。RAAS與高血壓的發生發展和血管重構、靶器官損傷關系密不可分，血管緊張素Ⅱ灌注的大鼠血壓明顯增高，并呈現血管重構方面的形態學改變和IR，經應用噻唑烷二酮類藥物IR得到糾正，伴有血壓降低和血管重構形態方面的改善，而噻唑烷二酮類藥物是通過AT1、PI-3K、TNF-α等途徑發揮降壓和防止血管重構的作用，并認為其對AT1R的作用至關重要〔7，8〕。

本研究發現SHR心肌間血管內皮細胞著色明顯，出現黃褐色顆粒，并有部分心肌細胞內出現黃褐色顆粒。說明AT1R含量較高，其原因可能是調控AT1R的基因轉錄活躍，致使mRNA表達相應增加，使AT1R表達量提高。另一種可能的解釋就是mRNA降解緩慢，作用時間延長，使AT1R表達量提高。AT1R和mRNA在心肌間血管內皮細胞和部分心肌細胞內的表達提示兩方面的作用:(1)RAAS系統通過AT1R在SHR血管壁細胞的表達，參與和啟動血管內皮功能損傷、內膜下脂質沉積和纖維組織增生、平滑肌細胞遷移和增殖等一系列病理改變。成為高血壓導致血管重構、靶器官損傷至關重要的途徑，并可能促成和啟動動脈壁粥樣硬化病變的發生和發展。(2)左心室肥厚是高血壓心臟受損導致心功能不全和一些心律失常的重要原因，嚴重者可以在臨床導致心源性猝死。本研究結果顯示AT1R在部分心肌細胞和心肌間質細胞中表達，說明高血壓病在左室肥厚的形成和發展過程中RAAS參與其中。RAAS通過AT1R的作用誘發各種類型細胞(包括心肌細胞和心肌間質細胞、成纖維細胞等)肥大和增生，構成高血壓左室肥厚的組織學基礎。

經PIO配合生活干預治療后AT1R和mRNA在大鼠心肌及主動脈的表達呈現出相同的變化規律。黃褐色顆粒在心肌間血管內皮細胞和部分心肌細胞中出現的比例和灰度均明顯降低。說明經PIO配合生活干預治療SHR心肌AT1mRNA和受體表達受到抑制。提示這種組合治療可能對SHR血管和心臟重構具有減緩或阻止作用。

總之，本研究結果顯示PIO配合生活方式干預可以明顯降低SHR的血壓，并對SHR AT1mRNA和受體的表達產生抑制作用，發揮降壓和心血管保護作用。

1 Reaven GM.Insulin resistance hyperinsulinemia and hypertriglyceridemia in etiology and clinical course of hypertension〔J〕.Am J Med，1991;90:7s-12s.

2 陳海燕，李 杰，王 威.吡格列酮配合生活方式干預對SHR大鼠降壓及主動脈壁保護作用的研究〔J〕.中國老年學雜志，2010;30(13):1854-6.

3 Zemel MB.Insulin resistance vs.hyperinsulinemia in hypertension:insulin regulation of Ca2+transport and Ca2+regulation of insulin sensitivity〔J〕.J Nutr，2005;125(6 Suppl):1738S-1743S.

4 Guo X，Cheng S，Taylor KD，et al.Hypertension genes are genetic markers for insulin sensitivity and resistance〔J〕.Hypertension，2005;45:799-803.

5 王 威，孔 儉，李 杰，等.吡格列酮配合生活方式干預對SHR大鼠降壓作用的研究〔J〕.中國老年學雜志，2010;30(14):1988-90.

6 王 威，孔 儉，陳海燕，等.吡格列酮配合生活方式干預對SHR大鼠血壓及糖脂代謝的影響〔J〕.中國老年學雜志，2010;30(18):2629-30.

7 Schiffrin EL，Amiri F，Benkirane K，et al.Peroxisome proleferator-activated receptor vascular and cardiac effects in hypertension〔J〕.Hpertension，2003;42(9):1295-314.

8 陳海燕，李 杰，梁虹霞.羅格列酮對SHR大鼠降壓作用和靶器官保護機制研究〔J〕.中國老年學雜志，2007;27(20):1970-3.