人CCL21基因克隆及其序列分析

劉長王瑩 崔 凱 李 勝*

（1 臨沂大學商學院，山東 臨沂 276000；2 山東省腫瘤防治研究院，山東 濟南 250117）

次級淋巴組織趨化因子（secondary lymphoid tissue chemokine，SLC）屬于CC亞族趨化因子，即CCL21，是由Nagria[1]在人基因表達序列標簽（expressed sequence tag，EST）數據庫中克隆出的趨化因子，CCL21的基因定位于9p13，其cDNA序列包括847個堿基，由4個外顯子和3個內含子組成，其分子量約為14KD，由134個氨基酸殘基組成，其中23個氨基酸殘基為信號肽序列，111個氨基酸的成熟肽含有4個半胱氨酸殘基，與其他人類CC型趨化因子有21%～33%的同源性，但有其獨特的約30個氨基酸組成的羧基末端延伸，該延伸內包含2個半胱氨酸殘基。CCL21主要存在于外周次級淋巴組織，如脾、淋巴結等部位，它具有較強的趨化作用，特別是對樹突狀細胞，T細胞與自然殺傷細胞，能使其聚集到外周淋巴組織或器官，而外周淋巴組織是免疫應答發生的初始部位。Campebell等[2]研究證實：在流動狀態下CCL21能誘導循環T細胞快速粘附到高內皮小靜脈（high endothelial venules，HEV）上，參與淋巴細胞和樹突狀細胞（dendritic cell，DCs）的歸巢和遷移。CCR7是CCL21的高親合力受體，CCL21具有種屬特異性，人CCL21只與CCR7相結合，而小鼠CCL21不僅與CCR7也與CXCR3結合[3]。為進一步探索CCL21在腫瘤基因治療中的應用，本實驗中我們成功克隆了人CCL21基因并進行了序列分析。

1 材料與方法

1.1 淋巴結組織及質粒、菌種

胃癌患者手術清掃下來的新鮮淋巴結組織取自山東大學附屬齊魯醫院，經患者家屬同意后收集進行實驗；pEASY-T1 simple cloning kit購自北京全式金生物技術有限公司；Trans109化學感受態細胞購自北京全式金生物技術有限公司。

1.2 主要儀器和設備

YJ-1450D 型醫用凈化工作臺；ABI PRISM 3100-Avant Genetic Analyzer全自動DNA測序儀；TGL-18R高速低溫離心機；PB303-電子精密天平；ABI 9700 PCR儀；WH-1微型漩渦混合儀；移液器2μl、10μl、20μl、100μl、200μl、1000μl；-20℃低溫冰箱；DYY-皿型電泳裝置等。

1.3 主要試劑

Trizol試劑購自Invitrogen公司；逆轉錄酶、TaqDNA聚合酶、XbaⅠ、NotⅠ內切酶購于大連寶生物工程有限公司（TAKARA產品）；T4 DNA連接酶、DNA marker、質粒DNA小提試劑盒購于北京天根生物技術公司；膠回收試劑盒均系MBI fermenters公司產品；酵母提取物、蛋白胨和瓊脂糖均購于英國OXOID公司。

1.4 引物設計及合成

CCL21引物設計：應用primer 5.0軟件設計引物，由上海生物工程有限公司合成。

上游引物：5’-GCtctagaatggctcagtcactggctct-3’；下游引物：5’-ATATgcggccgcctatggccctttaggggtctgt-3’。

1.5 總RNA的提取及濃度測定

取新鮮淋巴結組織約100mg，采用Trizol法提取總RNA，以隨機六聚體為引物合成cDNA，以此cDNA為模板，以P1、P2為引物，先94℃預變性5min，再以94℃ 45s，48℃ 45s，72℃ 1min 進行35個循環，最后72℃延伸7min。以此次PCR產物為模板，以P1、P2為引物，先94℃預變性5min，再以94℃ 45s，58℃ 45s，72℃1min進行30個循環，最后72℃延伸7min。1%的瓊脂糖凝膠電泳分離分析PCR產物，用膠回收試劑盒純化回收擴增的目的基因。

1.6 基因克隆及測序

將純化回收PCR片段與克隆載體pEASY-T1按摩爾數5∶1加入連接反應體系內，室溫連接4h后轉化Trans109感受態，37℃培養過夜，挑取菌落PCR陽性的單個菌落于LB+Amp的培養液37℃振蕩培養過夜，小量提取質粒DNA，經XbaⅠ、NotⅠ雙酶切初步鑒定后，由本室采用ABI PRISM 3100-Avant Genetic Analyzer全自動DNA測序儀完成測序。

2 實驗結果與分析

2.1 人CCL21基因克隆

從淋巴結組織中提取RNA，經逆轉錄獲得cDNA，以此為模板及上下游引物進行PCR擴增，擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳顯示擴增片段約425bp，與目的基因大小相符（圖1）。

圖1 人CCL21基因的PCR擴增

（附：CCL21基因序列：GCTCTAGAATGGCTCAGTCACTGGC TCTGAGCCTCCTTATCTTGGTTCTGGCCTTTGGCATCCCCAGGAC CCAAGGCAGTGATGGAGGGGCTCAGGACTGTTGCCTCAAGTAC AGCCAAAGGAAGATTCCCGCCAAGGTTGTCCGCAGCTACCGGA AGCAGGAACCAAGCTTAGGCTGCTCCATCCCAGCTATCCTGTTC TTGCCCCGCAAGCGCTCTCAGGCAGAGCTATGTGCAGACCCAAA GGAGCTCTGGGTGCAGCAGCTGATGCAGCATCTGGACAAGACAC CATCCCCACAGAAACCAGCCCAGGGCTGCAGGAAGGACAGGGG GGCCTCCAAGACTGGCAAGAAAGGAAAGGGCTCCAAAGGCTGC AAGAGGACTGAGCGGTCACAGACCCCTAAAGGGCCATAGGCGG CCGCATAT）

2.2 瓊脂糖電泳雙酶切鑒定

重組質粒pEASY-T1-CCL21用限制性內切酶XbaⅠ與NotⅠ雙酶切，鑒定插入目的片段。由于所選用的pEASY-T1 simple cloning vector是不帶任何酶切位點的克隆載體，所以不管目的片段插入方向如何，雙酶切后只得到一種結果，一條位于約425bp條帶，一條位于約3900bp處（圖2）。

圖2 質粒pEASY-T1-CCL21的酶切鑒定

2.3 重組質粒的序列分析

將酶切鑒定陽性含目的基因的菌液保存，并送于上海博尚生物技術有限公司進行序列分析（圖3），結果顯示獲得的目的基因序列與基因庫中CCL21基因序列一致，說明成功克隆出CCL21基因片段。

3 討 論

圖3 pEASY-T1 simple-CCL21質粒構建后測序結果

本研究采用的是基因克隆技術，基因克隆（gene cloning）是20世紀70年代發展起來的一項具有革命性的研究技術，可概括為：分、切、連、轉、選。“分”是指分離制備合格的待操作的DNA，包括作為運載體的DNA和欲克隆的目的DNA；“切”是指用序列特異的限制性內切酶切開載體DNA，或者切出目的基因；“連”是指用DNA連接酶將目的DNA同載體DNA連接起來，形成重組的DNA分子；“轉”是指通過特殊的方法將重組的DNA分子送入宿主細胞中進行復制和擴增；“選”則是從宿主群體中挑選出攜帶有重組DNA分子的個體。基因工程技術的兩個最基本的特點是分子水平上的操作和細胞水平上的表達，而分子水平上的操作即是體外重組的過程，實際上是利用工具酶對DNA分子進行“外科手術”。Berg等[4]于1972年把一種猿猴病毒的DNA與λ噬菌體DNA用同一種限制性內切酶切割后，再用DNA連接酶把這兩種DNA分子連接起來，于是產生了一種新的重組DNA分子，從此產生了基因克隆技術。一般來說，基因克隆技術包括把來自不同生物的基因同有自主復制能力的載體DNA在體外人工連接，構建成新的重組DNA，然后送入受體生物中去表達，從而產生遺傳物質和狀態的轉移和重新組合。因此基因克隆技術又稱為分子克隆、基因的無性繁殖、基因操作、重組DNA技術以及基因工程等。本實驗選用T-Vector法基因克隆，因Taq DNA酶擴增的PCR產物，其DNA雙鏈前后末端都有一個游離的A堿基，而pEASY-T1 simple cloning Vector末端游離的T堿基與其互補形成環狀重組T質粒。

許多研究表明，CCL21/CCR7軸在多種腫瘤的播散和器官特異性轉移中發揮著重要的作用[5-12]。CCL21通過趨化T細胞、DC、NK細胞，介導T細胞、NK細胞依賴的抗腫瘤免疫應答，分泌IFN-γ、TNF-α、GM-CSF、IL-12等細胞因子，改善腫瘤微環境，促進全身的細胞免疫應答，抵抗腫瘤細胞分泌的免疫抑制因子導致的免疫逃避，促進血管抑制性因子的分泌來抑制血管生成以及誘導腫瘤細胞的凋亡等來發揮抗腫瘤免疫效應。但CCL21/CCR7相互作用具有雙向效應，可促進腫瘤細胞分泌蛋白水解酶，加快腫瘤細胞的侵襲轉移，導致腫瘤進一步發展；因此，深入探析CCL21/CCR7與腫瘤侵襲轉移作用機制，阻斷其不利效應，為CCL21成為腫瘤生物治療和免疫治療新靶點提供全面保障。

綜上所述，利用PCR技術獲得目的基因片段CCL21，將其插入pEASY-T1 simple cloning vector，行酶切鑒定及目的基因序列分析，所獲得的人CCL21基因序列與GenBank報道的人CCL21序列一致。我們成功克隆了人CCL21基因，為下一步實驗研究奠定了基礎。

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