建立穩定性指示性的分析方法在藥物分析領域的研究進展

郝 福 胡向青

（以嶺醫藥集團研究院，北京 101500）

穩定性指示性的分析方法（Stability-indicating method）是指一種應用于制藥工業中穩定性樣品的測試方法，利用這類方法測定樣品能夠反映出在穩定性試驗條件下產品質量的變化。FDA、ICH、EMEA等各類藥政部門都對該方法有嚴格的要求。這種方法因為具有良好的專屬性，因此被廣泛地應用于藥物的質量控制、藥物的穩定性研究、及體內藥物分析等領域，本文綜述了這一方法在藥物分析領域的研究進展。

1 穩定性指示性分析方法的各種法規要求

美國聯邦法典[1]21CFR 211.166（a）3要求“穩定性測試方法應該是一個可信賴的專屬性方法”。FDA“穩定性試驗研究指南（1998）”里指出[2]，對于已經驗證過的定量分析方法應該具有良好的專屬性。ICH的Q1A（R2）里提到[3]，穩定性測試的分析方法應該經過全面地驗證并且具有穩定性指示性的特點。ICH的Q2A和Q3B里要求[4,5]，對于藥物的含量測定和雜質（或降解產物）測定，需要建立并驗證一個穩定性指示性的分析方法。

建立科學的穩定性指示性方法，對于制藥研發部門來說，它不僅可以間接地為患者提供了安全有效、穩定的產品，而且可以降低商業運作過程中的風險，樹立制藥企業的聲譽。

2 建立穩定性指示性分析方法的技術要求

隨著科技的進步和科研實力的提高，多種先進的分析手段被應用到藥物分析領域，如HPLC、UPLC、GC、CE等，這些方法都是基于各種分離機理設計的，廣泛地收載于各國藥典；另外一些方法，如紫外/可見分光光度法、比色法、衍生化法、滴定法等，這些方法專屬性較差，因此實際應用經常受到限制。

各種法規對于“穩定性指示性方法”的解釋都強調了一個詞匯“專屬性”，通常采用以下幾種手段達到判斷方法專屬性的目的：①降解研究，即樣品經過放置在強力破壞的試驗條件下測定，如光、熱、濕、酸堿水解及氧化條件，降解試驗能在很大程度上對分析方法的專屬性進行驗證。②考察臨界分離度，即用兩個洗脫程度最接近的化合物的分離度來證明其專屬性。③在空白基質或輔料中定量地加入主成分或雜質，與未添加的樣品測試結果進行比較，以證明其測定結果不受這些物質的影響。

檢索國內外相關的指導原則，未見對強制降解試驗的具體試驗條件作明確的規定。本文在檢索相關資料[6-9]的基礎上，歸納了強制降解試驗的常規項目與部分試驗條件，見表1。

每種試驗條件均需要平行制備空白溶劑對照、空白輔料對照或其他質控樣品，以判斷所產生的降解物質或未知峰的來源。在設計各項目的具體試驗條件時，應結合藥物的劑型、工藝條件等進行綜合考慮，掌握合適的強制降解試驗程度，一般控制主成分降解5%～10%為最佳破壞條件；對于用色譜理論建立的測試方法，還需要計算破壞后整個物質的回收率，即物料平衡，回收率應達到95%～105%，避免因為檢測系統選擇不佳導致部分雜質/降解產物漏檢的問題。對于破壞性試驗中產生的較大降解產物，必要時進行定性分析。

表1 典型的原料藥/制劑降解研究的試驗條件

建立穩定性指示性方法，主要有以下幾個步驟[6-9,14]：①首先剖析待分析物的化學結構，評估可能的降解途徑；從化學結構可以獲得很多信息，功能基的種類可以預測化合物的穩定性及溶解性等，如酰胺、酯、內酰胺、內酯都容易水解，硫醇、硫醚容易被氧化等。②收集化合物的物理、化學信息，如溶解性、pKa、logP、最大吸收波長、晶形、熱穩定性、原輔料相容性等；③開展降解研究，利用降解研究的樣品開展初步的分離試驗；對于液相色譜，利用PDA檢測器或質譜檢測器可以評價峰純度。④方法的最終建立和優化；⑤對降解產物進行結構鑒定，制備雜質對照品；質譜技術在藥物降解產物或代謝物的定性、定量研究中日益發揮著越來越重要的作用。

3 對分析方法進行驗證

對于不同類型的分析方法有不同的驗證要求，美國藥典將分析方法分為4類，對每一種類型的方法都提供了要求[10]，見表2。

4 穩定性指示性分析方法在藥物分析中的應用

4.1 穩定性指示性HPTLC法的應用進展

HPTLC法（高效薄層色譜法）是將傳統的薄層色譜法儀器化，采用高效薄層板和高質量的薄層掃描儀，大大提高了薄層板的分離能力和定量結果的準確性與重復性。

Faiyazuddin等[11]建立了具有穩定性指示性的HPTLC法測定硫酸特布他林原料藥及制劑產品中的含量，作者考察了硫酸特布他林在酸、堿、氧化、光照條件下各斑點的分離情況，結果各降解產物與主成分分離度均良好。Mostafa等[12]建立了穩定性指示性的薄層色譜掃描法測定撲熱息痛原料藥和制劑的含量，結果，撲熱息痛的Rf值為0.32，其它兩個降解產物的Rf分別為0.45和0.76。EI-Saharty等[13]建立并驗證了測定鹽酸匹哌氮酯原料藥含量的薄層掃描法，結果該方法可以特異性地檢測在有堿降解產物存在的條件下鹽酸匹哌氮酯的含量，鹽酸匹哌氮酯和其堿降解產物的Rf值分別為0.28和0.51。

表2 分析方法驗證指標的要求

HPTLC法可以使用少量的溶劑同時運行多個樣品，分析效率較高，但是因為該方法缺乏優良的檢測限、變異性、重復性，今后的應用還需加強研究，然而，該方法非常適宜于藥物的初始降解研究，它配合HPLC可以跟蹤降解產物的個數，并適量分離制備一些雜質[14]。

4.2 穩定性指示性HPLC/UPLC法的應用進展

HPLC法具有分析準確度好、選擇好、重復性好、靈敏度高等優點，不論藥物極性的大小，熱穩定性好壞等都可以使用HPLC法檢測，因此該法廣泛地應用于藥物雜質及降解物的分析檢測。

Kasawar等[15]建立了穩定性指示性的HPLC法同時測定復方硫酸沙丁胺醇和異丙托溴銨鼻噴劑中的有關物質，該方法采用梯度洗脫，使用峰純度指數評價降解研究中雜質的分離情況，并系統考察了方法的耐用性情況。Srinivasu等[16]建立并驗證了穩定性指示性的梯度HPLC法，該方法可以特異性地檢測乙酰唑胺及其有關物質。作者研究了各種強制條件下雜質分離和檢出情況，對含量較大的降解產物采用LCMS、FTIR and 1H/13C NMR進行了結構鑒定，結果，該方法對乙酰唑胺與其4個已知雜質及降解產物間的分離度都不低于2.0。Rao等[17]建立并驗證了用于測定原料藥及制劑中硫酸氫氯吡格雷片及其有關物質的正相HPLC法，該方法能夠分離所有已知雜質包括異構體雜質。

UPLC因為具有分析速度快，分離效率高的優點已逐漸進入藥品質量控制領域。Lakshmi Narasimham等[18]建立并驗證了一個可以同時檢測β受體阻斷劑和利尿藥的UPLC法，所有化合物在3.3min內都達到了很好的分離，堿降解研究結果表明，2種新降解產物都用UPLC/MS進行了結構鑒定，該方法按照ICH指南進行了系統的方法驗證。

綜上所述，在藥品的雜質控制上，穩定性指示性HPLC法被廣泛應用，多組分同時檢測、特殊色譜柱的使用、PDA檢測器的推廣使用、系統深入的降解研究是今后穩定性指示性HPLC法發展的共同趨勢。

4.3 穩定性指示性GC法的應用進展

GC作為穩定性指示性的方法有它的使用局限性，它要求藥物容易揮發、熱穩定性要好；有時為了增加藥物的可揮發性而選擇升高溫度，將導致某些物質的降解或再次降解。因此，僅有少量的文獻報道[19,20]使用GC法用于藥物的含量或雜質的測定。

4.4 穩定性指示性CE法的應用進展

毛細管電泳（CE）是以毛細管為分離通道、以高壓直流電場為驅動力的新型液相分離技術，具有高靈敏度、高速度、高分辨率、所需樣品少、成本低等優點。

Baalbaki等[21]建立并驗證了用于測定異西噴地軟膏含量的穩定性指示性的區帶毛細管電泳法，藥物和內標物在3min內分析完畢，檢測限度為0.5mg/L。Hamdan等[22]建立并驗證了測定鹽酸二甲雙胍片含量的穩定性指示性的CE法，通過降解研究結合峰純度評價，建立了該方法的穩定性指示性的能力。Alnajjar等[23]建立并驗證了測定諾氟沙星及其脫羧降解產物含量的穩定性指示性的CE法，對于這兩個化合物，分析方法的線性范圍較寬，能夠達到0.11mg/L的檢測限度。中草藥的質量控制中也常常用到穩定性指示性的CE法，Song等[24]建立并驗證了毛細管區帶電泳法測定附子中的6種生物堿含量，通過篩選緩沖溶液體系、pH、有機改性劑、高氯酸的濃度等因素建立了分析方法，并且利用酸、堿、氧化等強制降解因素優化了分析方法。

4.5 其他方法

E1-Bardidy等[25]建立了電化學分析法同時測定對氯苯氧乙酸二甲胺基乙酯鹽酸鹽和吡硫醇二鹽酸鹽一水化物的含量，通過降解試驗和HPTLC法制備了降解產物，考察了方法的專屬性。Badawy等[26]研究了他扎羅汀的穩定性并且建立了兩種穩定性指示性的分析方法—一階導數分光光度法和比光譜導數法，這種方法可以在有其堿性降解產物存在的情況下測定他扎羅汀的含量。

5 展 望

FDA在藥品注冊申報的批準前現場檢查中，經常審核分析方法的專屬性問題。檢索FDA網站關于“穩定性指示性分析方法”的缺陷信[27]，結果從2001至2010年，共有33份警告信；從2009年至2010年，共10份，結果體現了藥政部門對今后分析方法的審核越來越嚴格。藥品質量控制理念在逐步提升，從“藥品質量是檢驗出來的”到“藥品質量是生產出來”，再到“藥品質量是設計出來的”這一核心轉變，伴隨著新儀器、新技術的產生，穩定性指示性藥物分析方法的應用步入了新的階段，快速、高專屬性、高選擇性、高樣品處理能力是今后這一領域的發展趨勢。

[1]Code of Federal Regulations,Title 21,Volume 4,Revised as of April 1,2010.

[2]FDA,Guidance for industry: Stability testing of drug substances and drug products.Food and Drug Administration,1998.

[3]ICH Q1A (R2) Stability testing of new drug substances and products.International Conference on Harmonization,step 4,2003.

[4]ICH Q2A Text on validation of analytical procedures.International Conference on Harmonization,1994.

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[27]FDA.http://www.accessdata.fda.gov/scripts/warningletters/wlSearchResult.cfm?Qry Str=stability+indicating+method&Search=Search.