螺旋藻對人外周血淋巴細胞增殖的作用

羅 夏 包志強 孫樹青 楊麗敏

螺旋藻（Spirulina）富含優(yōu)質蛋白質、維生素、多種礦物質、微量元素和γ－亞麻酸等不飽和脂肪酸及β－胡蘿卜素等，所含人體必需氨基酸與聯合國糧農組織（FAO）及世界衛(wèi)生組織（WHO）所推薦的人體需要量（RDA值）極其相近［1］，所含多種生物活性物質，具有高消化吸收率，因而被FAO和世界食品協會譽為“人類最理想和21世紀最佳食品”。研究表明，螺旋藻安全、無毒，并且具有抗輻射、抗貧血、抗氧化、抗疲勞、抗腫瘤、抗衰老等作用［2］。但其對人體免疫細胞（淋巴細胞等）的生物學效應還未見報道。本實驗研究螺旋藻水提物對人外周血淋巴細胞體外增殖能力的影響。

1 資料與方法

1.1 材料

1.1.1 血液：由呼和浩特市中心血站提供健康人新鮮靜脈血，即刻使用。

1.1.2 藥品及試劑：實驗用螺旋藻源自鄂爾多斯高原堿湖，由內蒙古加利螺旋藻業(yè)有限責任公司提供，鏡檢為生長良好、純度較高的野生鈍頂螺旋藻，藻粉為干凈藻泥經120℃瞬時噴霧干燥后產品。刀豆蛋白A IV型（Con A IV型）為白色易溶凍干粉末，購于美國Sig ma公司。注射用植物血凝素（PHA），每支含凍干粉劑10 mg，購于美國Sig ma公司。

RPMI 1640培養(yǎng)基由美國Gibco公司生產；無鈣鎂PBS（國產試劑配制）、胎牛血清（FBS）由杭州四季青生物工程材料有限公司生產；胰蛋白酶由美國Gibco公司生產；淋巴細胞分離液購自中科院生物工程研究所；二甲基亞砜（DMSO）、四甲基偶氮唑鹽（MTT）購于美國Sig ma公司。其余試劑均為國產分析純。

1.1.3 儀器：CO2培養(yǎng)箱（美國 For maSeientifie公司，31645／N32221－1935型）；酶標儀（美國 Bio－Rad公司，i Mar k型）；超純水儀（德國 Millipore公司，M293986型 ）。

1.2 方法

1.2.1 螺旋藻水提物制備及Con A、PHA溶液的配制：稱取螺旋藻粉，按1∶20加入I級純化水溶解，充分緩慢攪拌均勻，將溶解液－20℃冷凍，4℃融解，反復凍融3～4次并進行超聲波破碎，所得細胞懸液用低速離心機離心后取上清液。上清液用透析膜透析，透析后得到膜內和膜外液體，分別冷凍過夜，再放入冷凍干燥機中干燥，最后收集粉末，即為螺旋藻水提膜內物和膜外物。精確稱取Con A及PHA粉劑，用RPMI－1640液分別配制成20μg／ml和100μg／ml溶液，0.22μm濾膜過濾除菌，4℃保存。

1.2.2 淋巴細胞分組及體外培養(yǎng)方法：取上述靜脈血50 ml用淋巴細胞分離液離心（2 000r／min，15 min），輕取白霧層，用 RPMI 1640液離心（800 r／min，6 min）2次，重懸，調整細胞密度為5×106個／ml，同時行臺盼藍染色，觀察細胞存活率大于95%，將細胞懸液按每孔0.1 ml接種于96孔培養(yǎng)板中，每組6孔。分為正常對照組、Con A和PHA陽性對照組、螺旋藻水提物膜內和膜外組，兩陽性對照組和兩螺旋藻水提物組均按20μg／ml和100μg／ml不同濃度的藥液加入各孔，每個濃度6孔，終體積均以RPMI 1640液補至每孔200μl。將培養(yǎng)板置入37℃，5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內，繼續(xù)培養(yǎng)72h。

1.2.3 MTT法檢測細胞增殖能力：培養(yǎng)結束前4h，每孔加入 MTT（5 g／L）20μl，繼續(xù)孵育4h后，經2 000r／min，離心8 min后，輕輕吸棄上清液，每孔加入DMSO 150μl，輕輕振蕩5 min，室溫靜置10 min，490n m波長處檢測其吸光度（OD）值，并按下述公式分別計算各組淋巴細胞增殖率。

增殖率 ＝ （藥物組OD－對照組OD）／對照組OD×100%

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，首先對各組數據進行正態(tài)檢驗（normality Plots with Tests），方差齊時采用單因素方差分析（One－way ANOVA），方差不齊時采用非參數檢驗（Nonparametric Tests）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

在一定細胞密度范圍內，OD值大小可以反映活細胞數量，即與增殖率呈正比。本實驗結果表明，各種藥物均有刺激淋巴細胞增殖的作用，其增殖率高于正常對照組（P＜0.01）。PHA和Con A作為傳統(tǒng)的淋巴細胞激活劑均可不同程度提高淋巴細胞增殖率，并且與濃度有關，濃度高者增殖率也高；PHA促淋巴細胞增值作用強于Con A（P＜0.05），與文獻報道［3］一致。螺旋藻水提物對淋巴細胞亦有提高增殖率作用，高濃度水提膜內物強于膜外物（P＜0.01）；100μg／ml水提膜內物促淋巴細胞的增殖作用比PHA更強（P＜0.05），而水提膜外物（20μg／ml）與相同濃度PHA的作用等效（P＞0.05）。由此可見，螺旋藻高劑量水提膜內物和低劑量水提膜外物提高淋巴細胞的增殖率作用強于Con A，而與PHA作用等效。見表1和圖1。

表1 不同藥物對正常淋巴細胞增殖作用的影響（±s，n均＝6）

表1 不同藥物對正常淋巴細胞增殖作用的影響（±s，n均＝6）

注：與正常對照組比較，1）P＜0.01；與Con A組比較，2）P＜0.05；與螺旋藻膜外組比較，3）P＜0.01；與PHA（100μg／ml）組比較，4）P＜0.05

組別 藥物濃度（μg／ml） OD 增殖率（%）正常對照組 — 0.375±0.024—PHA 組 20 0.635±0.028 69.331）2）100 0.666±0.021 77.60 1）2）Con A 組 20 0.471±0.030 25.60 1）100 0.531±0.017 41.601）螺旋藻膜內組 20 0.586±0.022 56.27 1）100 0.695±0.012 85.33 1）3）4）螺旋藻膜外組 20 0.626±0.019 66.93 1）100 0.546±0.035 45.601）

3 討 論

圖1 不同藥物作用72h的淋巴細胞增殖率

螺旋藻是藍藻類的一個屬，廣泛分布于海洋或湖沼，尤其是鹽堿湖等［4］；螺旋藻是近年來國內外研究與開發(fā)的熱點，國內已先后研制了以螺旋藻為原料的抗輻射、抗氧化、抗腫瘤和抗衰老等藥品。螺旋藻具有特殊的生物活性，能有效消除體內自由基對組織細胞的損傷，提高免疫功能，預防疾病，促進人體健康［5］。免疫細胞包括巨噬細胞、淋巴細胞等，其在機體免疫調節(jié)中發(fā)揮重要作用，免疫細胞減少或功能缺失會使機體產生病變。淋巴細胞在有絲分裂原（如Con A、PHA等）刺激下，可進行新的DNA合成及細胞分化、增殖［6～8］，而增加淋巴細胞數量。與放射性同位素標記法和形態(tài)學方法比較起來，MTT比色法檢測淋巴細胞增殖更加簡便、準確、安全。

本實驗結果顯示，螺旋藻水提物能提高人淋巴細胞增殖率。與傳統(tǒng)的淋巴細胞增殖藥物相比，其作用有明顯提高，其中螺旋藻水提膜內物高劑量組的增殖率最高。這種作用可能與其分子量大小及分子激活情況有關。螺旋藻水提取物經過透析膜后，膜外物中為小分子量物質，容易作用于細胞，因此低劑量即可達到較高的增殖效果（圖1），而膜內物的作用，尤其高劑量組的增殖效果甚至超過了PHA，則與其分子激活、開啟或關閉不同的信號通路有關，反映出不同種類細胞在相同信號刺激下，以及同種類型細胞在不同信號刺激下對刺激的應答效果或程度可存在差異［9～12］。同時提示只有重視信號傳導通路的深入研究，才能探索出細胞生長抑制規(guī)律。至于螺旋藻哪種成分在人免疫系統(tǒng)中起主導作用有待進一步研究。

1 吳開國.螺旋藻對機體免疫調節(jié)的研究概況.廣西醫(yī)科大學學報，2004，21（1）：147～148.

2 涂 芳，楊 芳，鄭文杰，等.螺旋藻多糖的研究進展.天然產物研究與開發(fā)，2007，17（1）：115～118.

3 劉 英，程 翔，廖玉華.地爾硫卓對刀豆凝集素誘導單個核細胞細胞因子表達的影響.中國藥理學通報，2010，26（3）：376～378.

4 董 艷，劉曉婷，王淑娥，等.螺旋藻的降血糖作用.中國海洋藥物雜志，2008，27（3）：46～47.

5 張志娟，喬明霞，郝言芝，等.復合螺旋藻多糖對人肝癌7402細胞的抑制作用.陜西醫(yī)學雜志，2009，38（3）：279～281.

6 Lin JR，Zhou H，Lai XP，et al.Genetic identification of edible birds'nestbased on mitochondrial DNA sequences.Food ResearchInternational，2009，42（8）：1 053～1 061.

7 張 濤，趙 蕊，柳朝陽，等.川芎嗪對T淋巴細胞活化增殖的影響.中國老年學雜志，2009，29（13）：1 658～1 659.

8 陳光星，李曉娟，劉清平，等.青藤堿對T淋巴細胞活化增殖的影響.廣州中醫(yī)藥大學學報，2008，25（5）：425～428.

9 張 雷，鄭芙林，李珊珊，等.隱丹參酮對淋巴細胞增殖反應的影響.時珍國醫(yī)國藥，2010，21（1）：92～93.

10 Lee JB，Sriso mpor n P，Hayashi K，et al.Effects of str uctural modification of calciumspir ulan，a sulfacted poly－saccharide from－Spirulina platensis，on antiviral activity .Chem Phar m Bull，2007，49（1）：108～110.

11 Lo BNer M，Walsted A，Larsen R，et al.Enhance ment of human adaptive immune responses by ad ministration of a high－molecular－weight polysaccharide extract from the cya－nobacterium arthrospira platensis.J Med Food，2008，11（2）：313～322.

12 Majdoub H，Ben Mansour M，Chaubet F，et al.Anticoagulant activity of a sulfated polysaccharide from the green alga arthrospira platensis.Biochi m Biophys Acta，2009，1 790（10）：1 377～1 381.