預(yù)防性使用英夫利西單抗對(duì)肺氣腫模型大鼠氣道炎癥的影響研究Δ

張 程，張湘燕，羅溶溶，饒珊珊，夏 婧，張族勤，朱紹英（貴州省人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，貴陽市 550002）

腫瘤壞死因子-α（TNF-α）能參與慢性阻塞性肺疾病（COPD）氣道炎癥的形成[1～3]，因此其在肺氣腫等發(fā)病中的作用越來越受到重視。在國外，相關(guān)研究[4]提示，給予英夫利西單抗（TNF-α抑制劑）后，COPD患者氣道炎癥無明顯改善，考慮得到該結(jié)果的可能原因是其評(píng)估的是英夫利西單抗的治療作用而非其預(yù)防作用。本實(shí)驗(yàn)采取單純香煙熏吸方法建立肺氣腫大鼠模型，觀察預(yù)防性使用英夫利西單抗對(duì)模型大鼠血清和支氣管肺泡灌洗液（BALF）中TNF-α、白介素（IL）-8、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）水平及BALF中炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)、分類計(jì)數(shù)的影響，旨在探討預(yù)防性使用英夫利西單抗對(duì)模型大鼠氣道炎癥的影響，為臨床上尋找該類疾病可行的預(yù)防方法提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

550酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad公司）；DL-5低速大容量離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.2 試藥

黃果樹香煙（貴陽市卷煙廠，焦油含量：每盒19 mg）；英夫利西單抗（瑞士Cilag AG公司，批號(hào)：S20060024，規(guī)格：每瓶100 mg）；大鼠TNF-α、IL-8、MMP-9酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）檢測(cè)試劑盒（上海史瑞可生物科技有限公司）。

1.3 動(dòng)物

清潔級(jí)SD大鼠39只，♂，體重180～252 g，鼠齡10周，購自重慶第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)合格證號(hào)：SCXK（渝）2007-0005。

2 方法

2.1 分組給藥

將大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組和干預(yù)組，每組13只，參照筆者已發(fā)表文章[5]中自制的大鼠實(shí)驗(yàn)性被動(dòng)吸煙裝置對(duì)后2組建立肺氣腫模型。煙霧暴露達(dá)1個(gè)月時(shí)，以英夫利西單抗對(duì)干預(yù)組進(jìn)行干預(yù)，皮下注射，10 d 1次，按照文獻(xiàn)[6]報(bào)道劑量給藥，藥物經(jīng)生理鹽水溶解，每次給藥劑量為5 mg·kg－1，給藥量為0.2 mL。正常對(duì)照組和模型組大鼠皮下注射生理鹽水，10 d 1次，每次0.2 mL。實(shí)驗(yàn)過程中，模型組大鼠第40天時(shí)死亡1只，干預(yù)組第70天時(shí)死亡1只，原因均不明。第71天終止英夫利西單抗干預(yù)，第74天終止所有處理進(jìn)行檢測(cè)。

2.2 BALF中炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類計(jì)數(shù)與血清和BALF中TNF-α、IL-8、MMP-9的檢測(cè)

血清和BALF的收集方法[5]：各組大鼠終止所有處理后，從下腔靜脈抽取靜脈血5 mL，在5 ℃、2 000 r·min－1離心10 min，吸取上部血清，將其置于－70℃冰箱中保存待測(cè)。隨后，處死大鼠，暴露氣管與雙肺，將尖端磨平的12號(hào)針頭連接于5 mL注射器，經(jīng)氣管切口向左肺緩慢注入無菌生理鹽水3 mL，每次注入后立即回吸灌洗液（回收率為80%～90%），并經(jīng)紗布過濾，重復(fù)3次。吸取各組大鼠的BALF 0.5 mL至血細(xì)胞計(jì)數(shù)器上計(jì)數(shù)白細(xì)胞總數(shù)。剩余BALF離心，取其上清液移入無菌瓶?jī)?nèi)，并置于－70℃冰箱中待測(cè)。細(xì)胞沉淀重新混懸于磷酸鹽緩沖液（PBS）中，并制作4張細(xì)胞涂片，Wright-Giemsa染色作炎癥細(xì)胞分類（巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞）計(jì)數(shù)（至少計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞）。另取上述血清和BALF上清液按照試劑盒說明書的要求測(cè)定TNF-α、IL-8、MMP-9水平。

2.3 肺組織病理變化檢測(cè)和形態(tài)定量分析

取各組大鼠右下肺，以10%中性福爾馬林固定30 min后結(jié)扎氣管，隨后置于10%中性福爾馬林中浸泡26 h，其余右肺存于－70℃冰箱中待用。最后石蠟包埋、切片，常規(guī)蘇木精-伊紅（HE）染色，顯微鏡下觀察肺組織病理變化。每只大鼠取3個(gè)HE染色切片，每片隨機(jī)取上、中、下、左、右5個(gè)視野（避開大血管和支氣管），在每個(gè)視野正中心劃十字交叉線，計(jì)算與交叉線相交的肺泡隔數(shù)（NS）和每個(gè)視野內(nèi)肺泡數(shù)（Na），同時(shí)測(cè)出十字線總長(zhǎng)（L）和每個(gè)視野面積（S）。按公式計(jì)算平均內(nèi)襯間隔（MLI＝L/NS），以表示肺泡平均內(nèi)徑；平均肺泡數(shù)（MAN＝Na/S），以反映肺泡密度。病理組織讀片均采用雙盲法。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 BALF中炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類計(jì)數(shù)比較

與正常對(duì)照組比較，模型組和干預(yù)組大鼠BALF中白細(xì)胞總數(shù)、巨噬細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)及其占白細(xì)胞總數(shù)的百分比均明顯升高，巨噬細(xì)胞數(shù)占白細(xì)胞總數(shù)的百分比明顯降低（P均＜0.05）。與模型組比較，干預(yù)組大鼠BALF中白細(xì)胞總數(shù)、巨噬細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)及其占白細(xì)胞總數(shù)的百分比均明顯降低，巨噬細(xì)胞數(shù)占白細(xì)胞總數(shù)的百分比明顯升高（P均＜0.05）。各組大鼠BALF中炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類計(jì)數(shù)比較見表1。

表1 各組大鼠BALF中炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)比較（±s）Tab 1 Comparison of inflammatory cells count in BALF among those groups（±s）

表1 各組大鼠BALF中炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)比較（±s）Tab 1 Comparison of inflammatory cells count in BALF among those groups（±s）

與正常對(duì)照組比較：＊P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05vs.normal control group：＊P＜0.05；vs.model group：#P＜0.05

組別正常對(duì)照組模型組干預(yù)組巨噬細(xì)胞數(shù)占白細(xì)胞總數(shù)百分比/%88.36±1.64 80.67±1.87＊83.62±1.88＊#n 13 12 12白細(xì)胞總數(shù)（×108個(gè)/L）1.63±0.34 4.18±0.62＊2.54±0.28＊#巨噬細(xì)胞數(shù)（×108個(gè)/L）1.44±0.31 3.37±0.52＊2.12±0.24＊#中性粒細(xì)胞數(shù)（×108個(gè)/L）0.035±0.064 0.43±0.062＊0.17±0.023＊#中性粒細(xì)胞數(shù)占白細(xì)胞總數(shù)百分比/%2.16±0.31 10.42±0.90＊6.91±0.59＊#

3.2 大鼠血清和BALF中TNF-α、IL-8、MMP-9水平比較

與正常對(duì)照組比較，模型組和干預(yù)組大鼠血清和BALF中IL-8、TNF-α、MMP-9水平均明顯升高（P均＜0.05）。與模型組比較，干預(yù)組大鼠血清和BALF中TNF-α、MMP-9水平明顯降低（P均＜0.05），BALF中IL-8水平明顯降低（P＜0.05），血清中IL-8水平無明顯變化。各組大鼠血清和BALF中TNF-α、IL-8、MMP-9水平比較見表2。

表2 各組大鼠血清和BALF中TNF-α、IL-8、MMP-9水平比較（±s）Tab 2 Comparison of the levels of TNF-α，IL-8 and MMP-9 in serum and BALF（±s）

表2 各組大鼠血清和BALF中TNF-α、IL-8、MMP-9水平比較（±s）Tab 2 Comparison of the levels of TNF-α，IL-8 and MMP-9 in serum and BALF（±s）

與正常對(duì)照組比較：＊P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05vs.normal control group：＊P＜0.05；vs.model group：#P＜0.05

組別正常對(duì)照組模型組干預(yù)組BALF 2.94±0.62 6.89±1.61＊4.52±0.69＊#n 13 12 12 TNF-α/pg·mL－1血清22.55±3.07 39.14±4.38＊28.57±3.29＊#BALF 36.02±3.65 60.51±4.01＊41.47±5.31＊#IL-8/pg·mL－1血清23.87±3.28 60.58±6.88＊55.23±6.23＊BALF 80.18±10.51 161.13±23.90＊140.24±19.62＊#MMP-9/ng·mL－1血清3.77±0.40 8.34±1.15＊4.87±0.63＊#

3.3 肺組織病理變化與定量分析結(jié)果

顯微鏡下，正常對(duì)照組中少數(shù)大鼠可見輕度炎癥變化，其余無明顯異常，氣管內(nèi)表面纖毛豐富、整齊，未見脫落現(xiàn)象，氣管壁結(jié)構(gòu)清楚，在纖毛細(xì)胞間夾雜有少量杯狀細(xì)胞，肺組織結(jié)構(gòu)正常，肺泡間隔完整；模型組大鼠支氣管肺內(nèi)出現(xiàn)較多的慢性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，纖毛倒伏、脫落，杯狀上皮細(xì)胞化生，肺泡壁變薄或斷裂，肺泡腔擴(kuò)大，部分融合成肺大泡；干預(yù)組較模型組上述變化都相對(duì)減輕。與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠MLI明顯增加，MAN明顯減小（P均＜0.05）。與模型組比較，干預(yù)組大鼠MLI明顯減小，MAN明顯增加（P均＜0.05）。各組大鼠肺組織病理變化見圖1；MLI、MAN比較見表3。

圖1 各組大鼠肺組織病理切片圖（HE，×100）Fig 1Pathological slice of lung tissue of rat（sHE，×100）

表3 各組大鼠MLI、MAN比較（±s）Tab 3 Comparison of MLI and MAN among those groups（±s）

表3 各組大鼠MLI、MAN比較（±s）Tab 3 Comparison of MLI and MAN among those groups（±s）

與正常對(duì)照組比較：＊P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05vs.normal control group：＊P＜0.05；vs.model group：#P＜0.05

組別正常對(duì)照組模型組干預(yù)組MAN（×106個(gè)/m2）448.32±28.73 166.62±37.33＊316.81±57.05#n 13 12 12 MLI/μm 41.26±4.50 97.52±23.75＊57.69±7.37#

4 討論

TNF-α為一種重要的炎癥介質(zhì)，由巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞等釋放，可參與機(jī)體脂肪、蛋白質(zhì)的分解代謝等病理生理過程。其除了參與潰瘍性結(jié)腸炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等發(fā)病過程以外，還能促進(jìn)肺氣腫的發(fā)生、發(fā)展[7]，因此越來越引起人們的關(guān)注。本研究結(jié)果表明，肺氣腫模型大鼠血清和BALF中TNF-α水平較正常對(duì)照組明顯升高，二者差異具有顯著性，說明了其在肺氣腫氣道炎癥中的重要意義。

目前認(rèn)為TNF-α在COPD發(fā)病中的作用是：不但能激活中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等，促進(jìn)炎癥介質(zhì)釋放，還能活化炎癥細(xì)胞合成炎性細(xì)胞因子，在炎癥細(xì)胞-細(xì)胞因子之間形成逐步放大環(huán)，促使炎癥反應(yīng)及肺組織破壞；TNF-α能增強(qiáng)血管黏附分子和中性粒細(xì)胞化學(xué)趨向素或趨化因子等的表達(dá)，引起中性粒細(xì)胞的遷移和活化，導(dǎo)致破壞性的氧化劑和蛋白酶的釋放，促進(jìn)氣道炎癥的發(fā)生和持續(xù)發(fā)展。

鑒于TNF-α在上述多種疾病中的重要作用，目前有許多學(xué)者均致力于TNF-α抑制劑在臨床上的應(yīng)用研究。國外已有研究[6]以不同劑量（5、10、15 mg·kg－1）的英夫利西單抗干預(yù)結(jié)腸炎模型大鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干預(yù)組大鼠腸道炎癥等病理變化較模型組明顯減輕，其中低劑量組（5 mg·kg－1）療效最為顯著。說明該藥在臨床應(yīng)用中可能存在巨大的潛力，可望在COPD等具有類似發(fā)病特點(diǎn)的疾病治療中發(fā)揮重要作用，因此值得進(jìn)一步研究。但近期研究卻沒有得到人們預(yù)期的效果。有文獻(xiàn)[4]報(bào)道COPD患者使用英夫利西單抗治療后，不僅臨床癥狀無明顯好轉(zhuǎn)，其氣道炎癥也無明顯改善，推測(cè)該結(jié)果的可能原因與用藥時(shí)機(jī)有關(guān)，一旦COPD進(jìn)展到一定時(shí)期，其病理變化就很難逆轉(zhuǎn)，故治療效果欠佳。

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果筆者發(fā)現(xiàn)，煙霧暴露34 d左右大鼠才開始出現(xiàn)輕度肺氣腫，因此在煙霧暴露30 d時(shí)進(jìn)行干預(yù)即屬預(yù)防性使用，可能達(dá)到較好的預(yù)防效果。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組比較，干預(yù)組大鼠血清和BALF中TNF-α、MMP-9水平以及BALF中IL-8水平均明顯降低；其肺組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)也相應(yīng)減輕，BALF中中性粒細(xì)胞數(shù)占白細(xì)胞總數(shù)的百分比也明顯降低。其一方面進(jìn)一步驗(yàn)證了TNF-α在肺氣腫發(fā)病中的重要作用，另一方面還提示預(yù)防性使用英夫利西單抗可通過拮抗細(xì)胞因子和抑制局部炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)改善氣道炎癥；同時(shí)，由于反映肺氣腫程度的相關(guān)指標(biāo)也有所改善，所以筆者推測(cè)預(yù)防性使用英夫利西單抗可減輕肺氣腫模型大鼠的氣道炎癥，其可能通過拮抗細(xì)胞因子和抑制局部炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)而發(fā)揮作用。鑒于目前尚缺乏有效的對(duì)抗肺氣腫氣道炎癥的藥物，TNF-α抑制劑的抗炎作用值得在臨床上進(jìn)一步研究探討。

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