3種橡膠膏劑控制菌檢查的方法學驗證

趙新霞，楊淑先，劉 英，陶 明（河南省食品藥品檢驗所，鄭州市 450003）

橡膠膏劑系指中藥提取物或化學藥物與橡膠等基質混勻后，涂布于背襯材料上制成的貼膏劑。2010年版《中國藥典》增加了橡膠膏劑的微生物限度檢查，規定每10 cm2不得檢出金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌[1]。橡膠膏劑中除了主要藥用成分外，基質主要為橡膠，另外還含有凡士林、液體石蠟等脂溶性成分。因此選用合適的溶劑來分散基質，使藥品溶解，是橡膠膏劑微生物限度檢查中制備供試品溶液很關鍵的步驟，而合適的供試品溶液制備方法對微生物限度檢查結果也至關重要。筆者選用3種中藥橡膠膏劑，對其進行控制菌檢查的方法學驗證，以探究橡膠膏劑合適的供試品溶液制備方法及控制菌檢查方法[2，3]。

1 材料

1.1 樣品

壯骨麝香止痛膏（批號：100604、090701、100304，規格：7 cm×10 cm，主要成分：人工麝香、生草烏、生川烏、乳香、沒藥、生馬錢子、丁香、肉桂、荊芥、防風、老鸛草、香加皮、積雪草、骨碎補、白芷、山柰、干姜、水楊酸甲酯、薄荷腦、冰片、樟腦、蕓香浸膏、顛茄流浸膏）、冰樟桉氟輕松貼膏（批號：091016、100613、100203，規格：4 cm×6.5 cm，主要成分：醋酸氟輕松、冰片、樟腦、水楊酸甲酯、桉葉油）、通絡祛痛膏（批號：090604、100414、100604，規格：7 cm×10 cm，主要成分：當歸、川芎、紅花、山柰、花椒、胡椒、丁香、肉桂、蓽茇、干姜、大黃、樟腦、冰片、薄荷腦）均由河南羚銳制藥股份有限公司提供。

1.2 菌種

大腸埃希菌[CMCC（B）44 102]、金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26 003]、銅綠假單胞菌[CMCC（B）10 104]均由中國藥品生物制品檢定所提供。

1.3 培養基及稀釋劑

營養肉湯培養基（批號：080331）、膽鹽乳糖培養基（BL，批號：1003182）、甘露醇氯化鈉瓊脂培養基（批號：0808192）、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基（批號：071107）、營養瓊脂培養基（批號：100407）均為北京三藥科技開發公司產品；pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液為自制，按照2010年版《中國藥典》規定制備及滅菌。

2 方法與結果

2.1 菌液制備[1]

接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養物至營養肉湯培養基中，35℃培養22 h。上述培養物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1 mL含菌數為10～100 cfu的菌懸液，計數。2次菌落計數結果見表1。

表1 菌落計數結果（cfu）Tab 1Results of colony coun（tcfu）

2.2 供試液制備

2.2.1 供試品溶液的制備。取每批樣品4片，去掉膏劑的保護層，將無菌紗布覆蓋在膏劑的粘貼面上，共取100 cm2的面積，剪碎，將碎片置于含30 mL無菌十四烷酸異丙酯和無菌玻璃珠的輸液瓶中，充分振搖。然后加入pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100 mL，振搖，萃取，靜置使油水明顯分層。用注射器抽取水層，作為1∶10的供試品溶液。

2.2.2 陰性對照組。取30 mL無菌十四烷酸異丙酯，置于含無菌玻璃珠的輸液瓶中，加入100 mL pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，振搖，靜置使分層。取水層作為陰性對照液。

2.3 試驗方法

按照2010年版《中國藥典》一部“微生物限度檢查法”[1]進行方法學驗證，供試品檢查同步進行。取3種橡膠膏劑共9批樣品，試驗分2次進行。

2.3.1 供試品組。①金黃色葡萄球菌：取1∶10供試品溶液10 mL，加入100 mL營養肉湯培養基中培養24 h，分離劃線于甘露醇氯化鈉瓊脂平板上，依照金黃色葡萄球菌的檢查方法進行檢查。②銅綠假單胞菌：取1∶10供試品溶液10 mL，加入100 mL BL中培養24 h，分離劃線于溴化十六烷基三甲銨瓊脂平板上，依照銅綠假單胞菌的檢查方法進行檢查。

2.3.2 試驗組。①金黃色葡萄球菌：取1∶10供試品溶液10 mL及1 mL含10～100 cfu的金黃色葡萄球菌菌懸液，加入100 mL營養肉湯培養基中培養24 h，依照金黃色葡萄球菌的檢查方法進行檢查。②銅綠假單胞菌：取1∶10供試品溶液10 mL及1 mL含10～100 cfu的銅綠假單胞菌菌懸液，加入100 mL BL中培養24 h，依照銅綠假單胞菌的檢查方法進行檢查。2.3.3 陰性菌對照組。①金黃色葡萄球菌：取1∶10供試品溶液10 mL及1 mL含10～100 cfu的大腸埃希菌菌懸液，加入100 mL營養肉湯培養基中培養24 h，依照金黃色葡萄球菌的檢查方法進行檢查。②銅綠假單胞菌：取1∶10供試品溶液10 mL及1 mL含10～100 cfu的大腸埃希菌菌懸液，加入100 mL BL中培養24 h，依照銅綠假單胞菌的檢查方法進行檢查。

2.3.4 陰性對照組。①金黃色葡萄球菌：取陰性對照液10 mL，加入100 mL營養肉湯培養基中培養24 h，依照金黃色葡萄球菌檢查方法進行檢查。②銅綠假單胞菌：取陰性對照液10 mL，加入100 mL BL中培養24 h，依照銅綠假單胞菌的檢查方法進行檢查。

2.4 結果

3種橡膠膏劑共9批樣品，試驗結果均一致，見表2、表3（表中“+”表示有菌生長，“-”表示無菌生長）。

表2 金黃色葡萄球菌驗證試驗結果Tab 2 Results of verification test for Staphylococcus aureus

表3 銅綠假單胞菌驗證試驗結果Tab 3 Results of verification test for Pseudomonas aeruginosa

由以上結果可知，3種橡膠膏劑共9批樣品，供試品組、陰性對照組以及陰性菌對照組均無菌生長，試驗組均檢出試驗菌，確定這3種樣品的控制菌檢查均可采用此方法進行。

3 分析與討論

（1）供試品溶液制備方法的選擇，筆者曾采用以下方法進行試驗：

方法1：取每批樣品4片，去掉貼膏劑的保護層，將無菌紗布覆蓋在膏劑的粘貼面上，共取100 cm2的面積，剪碎，將碎片置于含4 mL聚山梨酯-80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100 mL中，用力振蕩30 min[1]。

方法2：取每批樣品4片，去掉貼膏劑的保護層，將無菌紗布覆蓋在膏劑的粘貼面上，共取100 cm2的面積，剪碎，將碎片置于含25 mL無菌十四烷酸異丙酯和無菌玻璃珠的輸液瓶中，充分振搖。然后加入pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100 mL，振搖，萃取，靜置使油水明顯分層。用注射器抽取水層，作為1∶10的供試品溶液。

方法3：除無菌十四烷酸異丙酯的用量改為30 mL外，其余均與方法2相同。

在方法1中，振搖后，紗布脫落，貼膏劑的粘貼面相互粘在一起，膏層難以溶解下來，用力振蕩，溶液幾乎沒有任何變化，所以方法1不適合于這3種橡膠膏劑供試品溶液的制備。以十四烷酸異丙酯為溶劑后，曾用20 mL的溶劑量，但樣品與溶劑混合得很不充分，所以選用25 mL的溶劑用量開始試驗。但在方法2中，加入無菌十四烷酸異丙酯充分振搖后，膏層溶解得不充分，所以方法3將十四烷酸異丙酯的量增加到30 mL，結果膏層完全溶解。所以最終選用方法3作為供試品溶液的制備方法。

（2）由于本試驗中所用十四烷酸異丙酯的量為30 mL，比一般用量（20 mL）[1]大，故作相應控制菌檢查時增加了陰性對照液的陽性試驗，即用10 mL陰性對照液代替供試品溶液做相應控制菌的陽性對照試驗。結果表明，陽性菌均檢出，說明本次試驗所用的十四烷酸異丙酯的量30 mL對控制菌的生長沒有影響。

（3）對于非水溶性供試品的供試液制備，需以十四烷酸異丙酯為溶劑進行溶解的，十四烷酸異丙酯的使用量是以能夠溶解供試品且對微生物的生長沒有影響為基礎來確定的。筆者曾進行了十四烷酸異丙酯的用量對微生物生長的影響試驗：采用2010年版《中國藥典》一部“微生物限度檢查法”[1]中非水溶性供試品的供試液制備中的第二法進行試驗，以大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌和黑曲霉為試驗菌，當十四烷酸異丙酯的用量增加到100 mL時，加入pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100 mL，振搖靜置后分別取水層1 mL，加入試驗菌，進行回收率的測定，結果表明試驗菌的回收率均高于70%。所以，試驗中十四烷酸異丙酯的用量對上述試驗菌的生長沒有明顯影響。

（4）試驗中3種中藥橡膠膏劑成分中均含有冰片[4]，具有抑菌作用；通絡祛痛膏中的大黃[5]也有抑菌作用。但因控制菌檢查時取1∶10供試品溶液的量為10 mL，其中抑菌成分的含量已較低，所以控制菌的生長沒有受到影響。

本次試驗所建立的控制菌檢查方法有效、可行，可用于所選3種橡膠膏劑的控制菌檢查；且3種橡膠膏劑均可采用常規法進行檢查。

[1] 國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（一部）[S].2010年版.北京：中國醫藥科技出版社，2010：附錄9、79.

[2] 李近磊，王嘉怡，遲丹怡，等.復方克林霉素凝膠微生物限度檢查法的方法驗證研究[J].中國藥房，2010，21（25）：2 380.

[3] 韋 曦，邱雙成，王翠榮.29種醫院制劑微生物限度檢查方法驗證[J].中國藥房，2008，19（1）：52.

[4] 劉 楠，鄒佳伶，王黎黎，等.龍腦油與阿莫西林的體外聯合抑菌作用觀察[J].中國獸醫雜志，2010，46（2）：56.

[5] 于風平，楊美琴，特玉香，等.含大黃、黃芩、黃連和黃柏藥材的中成藥微生物限度檢查法的建立[J].藥物分析雜志，2010，30（3）：558.