中藥聯合FTS抗大鼠梗阻性黃疸肝臟缺血再灌注損傷的研究

張 軍 傅永清 華 晨 陳炳榮 裘華森 王海娜 周 劍浙江中醫藥大學附屬第一醫院 杭州 310006

快速康復外科（fast-track surgery，FTS），最早由丹麥外科醫生Kehlet等提出[1]，它是指在術前、術中及術后應用各種已證實有效的方法以減少手術應激[2]。FTS已被證實在縮短住院時間、降低術后并發癥的發生率、死亡率、返院率及醫療費用等方面較傳統方法有明顯的優勢。快速康復計劃已在外科許多疾病中成功應用，其中結直腸切除手術的快速康復外科治療方案是其中較為成功的典范之一[3]，近年來國際上在心臟外科、泌尿外科、婦科中開展快速康復外科治療也見報道[4]。快速康復外科可以減少應激反應，促進患者術后快速康復[5]。然而肝膽外科中運用快速康復外科理念的研究論文仍較少見。本研究將中藥聯合快速康復外科治療手段作為干預因素，研究在梗阻性黃疸基礎上FTS對大鼠肝臟缺血再灌注損傷的保護作用。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 健康SD大鼠60只（由浙江中醫藥大學動物實驗研究中心提供），雌雄各30只，7周齡，體重（200±40）g。隨機分為假手術組、非 FTS 組、FTS常規組及FTS+中藥組，每組各15只。

1.2 藥品及試劑 3%戊巴比妥鈉（美國sigma公司，批號 P376）；四君子湯（黨參 12g，茯苓 9g，白術9g，甘草6g，購自浙江省中醫院，由其代煎為濃縮劑）；AST、ALT試劑盒（上海申能德賽技術有限公司，批號27016，26013）；蘇木精、伊紅染劑（浙江中醫藥大學動物實驗研究中心提供）；原位細胞凋亡檢測試劑盒（美國羅氏公司，批號11342000）。

1.3 主要儀器 移液器、天平、DU800分光光度儀、組織勻漿機等均由浙江中醫藥大學動物實驗研究中心提供。

2 實驗方法

2.1 模型建立 所有大鼠均行膽總管結扎（common bile ductligation，CBDI）制備為梗阻性黃疸模型，方法如下：大鼠按每100g體重0.13mL劑量的3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，取上腹部正中切口2～3cm，在距肝門0.5cm處用4-0絲線雙道結扎膽總管后關腹。所有操作均嚴格按照無菌原則進行。

2.2 實驗方法 本實驗研究共設置5個干預因素，分別是：術前禁食、禁水12h；術前生理鹽水灌腸1次；術中放置腹腔引流管；術后生理鹽水灌胃1次；術后禁食6h。以上干預措施在兩FTS組大鼠均不實施。FTS+中藥干預組予中藥2mL分別于術前1天、手術當天及術后1天灌胃1次，FTS常規組則不進行該操作。模型制備后第7天，進行第二次手術。假手術組僅進行開腹、關腹操作。非FTS組及兩FTS組均進行肝臟缺血再灌注操作。采用5-0血管縫線結扎門靜脈，缺血40min，再灌注時抽掉血管縫線再次開放門靜脈，術后予常規補液治療。

2.3 標本采集及檢測 開放門靜脈24h后，3%戊巴比妥鈉溶液麻醉（0.13mL/100g），5mL注射用針筒大鼠心臟取血，打開腹腔，用剪刀剪取肝臟組織約5g左右。

2.4 檢測指標及方法

2.4.1 ALT、AST檢測 血液樣本3 000r/min離心10min分離取血清，用全自動生化分析儀檢測AST、ALT水平，具體步驟按照試劑盒說明進行操作。

2.4.2 HE染色及TUNEL檢測 肝臟組織進行常規HE染色，TUNEL法檢測肝組織細胞原位凋亡，具體操作方法：切片置60℃烤箱烘烤2h；切片脫蠟；蒸餾水洗2min；高壓熱修復：高壓鍋內放適量自來水，將修復液倒入燒杯內，將燒杯置于高壓鍋內煮沸，將切片放入裝有修復液的燒杯內，蓋緊高壓鍋，加熱至設定壓力冒氣后持續2min，自來水冷卻；3%H2O2溶液阻斷過氧化物酶，10min；蒸餾水洗 2min，PBS洗3min；滴加一抗，37℃孵育 1h；流水沖洗 3min，蒸餾水洗 3min，PBS 洗 5min；滴加二抗，37℃孵育 60min；流水沖洗3min，蒸餾水洗3min，PBS洗 5min；DAB顯色2min；復染、透明后封片。HE染色下觀察大鼠肝細胞形態學變化，免疫組化染色后觀察各組肝臟細胞凋亡情況，計算凋亡指數（Apoptosis Index，AI）。判斷標準：以光鏡下觀察到肝臟細胞核呈棕色或棕褐色為原位凋亡細胞，光鏡下隨機選取5個視野，計數平均200個細胞中的陽性細胞數，以百分數表示。

3 實驗結果

3.1 各組大鼠血清ALT、AST水平 假手術組與FTS+中藥組、FTS常規組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；假手術組與非FTS組比較，AST、ALT值后者明顯高于前者（P＜0.05）；非 FTS組與 FTS+中藥組及 FTS常規組比較，AST、ALT值后兩者明顯低于前者（P＜0.05）；FTS+中藥組與 FTS 常規組比較，AST、ALT 值后者明顯高于前者（P＜0.05），見表1。

表2 各組大鼠肝臟細胞凋亡陽性指數比較（±s）

表2 各組大鼠肝臟細胞凋亡陽性指數比較（±s）

注：與假手術組比較，▲P＜0.01；與非 FTS 組比較，△P＜0.05

組 別 n/只 陽性指數/%假手術組 15 7.48±1.08非 FTS組 15 19.60±1.72▲FTS+中藥組 15 14.90±1.18▲△FTS 常規組 15 15.75±2.19▲△

表1 各組大鼠血清ALT、AST水平比較（±s）IU/L

表1 各組大鼠血清ALT、AST水平比較（±s）IU/L

注：與非 FTS 組比較，△P＜0.05；與 FTS 常規組比較，*P＜0.05

組 別 n/只 ALT AST假手術組 15 224.6±120.9△ 858.2±80.0△非 FTS 組 15 459.0±233.1 1237.8±202.5 FTS+中藥組 15 149.7±72.5△* 711.0±245.7△*FTS常規組 15 270.1±112.1△ 955.6±156.3△

3.2 大鼠肝臟HE染色形態學比較 在200倍光鏡下，各組均存在肝細胞變性壞死，表現為細胞核脹大，水樣變，核分裂等，非FTS組出現局部片狀壞死區，肝小葉中央靜脈周圍更加明顯；兩FTS組基本肝小葉結構保持完好。

3.3 大鼠肝臟細胞凋亡情況 各組均可見肝臟細胞凋亡，見圖1～4（封四），非FTS組及兩FTS組肝臟細胞凋亡程度明顯高于假手術組。假手術組凋亡指數顯著低于其他各組（P＜0.01），非FTS組高于兩FTS組（P＜0.05），FTS+中藥組與FTS常規組比較差異無統計學意義（P＞0.05），見表2。

4 討論

對膽汁淤積性黃疸患者進行肝臟手術造成缺血再灌注損傷，是導致患者術后短期內肝功能衰竭的主要原因。肝細胞的凋亡是肝臟缺血再灌注損傷的重要病理特征，細胞凋亡是細胞死亡的一種方式，直接反應了肝功能損害程度。大量肝細胞短期內凋亡勢必會造成肝功能失代償，甚者可發展為肝衰竭。

本實驗研究選取術前禁食、禁水12h，術前生理鹽水灌腸1次，術中放置腹腔引流管，術后生理鹽水灌胃1次，術后禁食6h作為常規外科操作手段，比較研究FTS在膽汁淤積性黃疸大鼠肝臟缺血再灌注損傷中的干預作用，選取四君子湯作為獨立干預因子。結果顯示，各組間大鼠血清ALT、AST水平相互比較，假手術組與FTS+中藥組、FTS常規組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；非 FTS組 AST、ALT 明顯高于假手術組（P＜0.05）；非 FTS組 AST、ALT 明顯低于FTS+中藥組及 FTS 常規組（P＜0.05）；FTS+中藥組AST、ALT 明顯高于 FTS常規組（P＜0.05）。在肝臟細胞形態方面，FTS組肝細胞變性壞死情況好于非FTS組，而在肝細胞凋亡方面，假手術組顯著低于其他各組（P＜0.01），非 FTS組高于兩 FTS組（P＜0.05），FTS+中藥組與FTS常規組無明顯差異（P＞0.05）。由此初步推測，FTS的因素干預，可減少肝細胞凋亡，降低肝功能的損傷程度。

四君子湯由人參、白術、茯苓、甘草四藥組成，功效健脾益氣，主治脾胃氣虛之證，該方用于外科手術患者術后元氣大傷，正氣不固，可以固正抗邪，降低術后創傷，促進患者術后康復。

[1]Wilmore DW，Kehlet H.Management of Patients in fast track surgery[J].BMJ，2001，322（7284）：473-476.

[2]江志偉，李寧，黎介壽.快速康復外科的概念及臨床意義[J].中國實用外科雜志，2007，27（2）：131-133.

[3]Wang G，Jiang ZW，Bao Y，et al.Clinical use of fast-tracksurgery in colorectal cancer patients：report of 116 cases[J].Zhonghua Wei Chang Wai Ke Za Zhi，2010，13（5）：342-345.

[4]Svircevic V，Nierich AP，Moons KG，et al.Fast-track anesthesia and cardiac surgery：a retrospective cohort study of 7989 patients[J].Anesth Analg，2009，108（3）：727-733.

[5]李志春，徐鵬遠.加速康復外科在肝膽外科的應用價值[J].昆明醫學院學報，2009，（3B）：231-234.