腫瘤靶向超順磁氧化鐵納米粒的小鼠急性毒性與抗吞噬性評價

高文慧，范彩霞，陳志良(1.南方醫科大學南方醫院藥學部，廣州市510515；.廣東省粵北人民醫院藥學部，韶關市5106)

超順磁氧化鐵納米粒(Superparamagnetic oxide iron nanoparticles，SPIO-NPs)是一種新型的磁共振造影劑，由于其所特有的小粒子、超順磁性和低毒性等特點，在磁靶向給藥和熱療等方面也具有突出的優勢。當SPIO-NPs的粒徑小于100 nm時，能逃避肝、脾的吞噬，達到全身分布，此時的納米粒能進入淋巴系統，被淋巴結內的巨噬細胞吞噬；如果發生腫瘤部位的淋巴結轉移，吞噬了SPIO-NPs的淋巴結正常組織的T2信號值將下降，而腫瘤組織的T2信號值不變，從而準確判斷腫瘤是否轉移以及轉移腫瘤的位置和大小。在以上SPIO-NPs的包被材料上嫁接腫瘤細胞表面某些特異性受體的配體后，SPIO-NPs就能特異性結合腫瘤組織，使其T2信號值下降，與周圍正常組織分清界限，確定腫瘤邊緣及大小[1]。本課題組(腫瘤靶向新型磁共振造影劑的研制與體內、外評價課題組)現已合成了超小粒徑的SPIO-NPs，并包被以羧甲基殼聚糖，以提高其溶液的穩定性和親水性，再在羧甲基殼聚糖上嫁接以葉酸，由于大部分腫瘤表面具有葉酸受體，嫁接了葉酸的SPIO-NPs在體內能靶向結合有葉酸受體的腫瘤組織，從而達到靶向造影腫瘤組織的目的[2]。本實驗旨在評價葉酸-羧甲基殼聚糖-SPIO-NPs(Folic acid-O-carboxymethyl chitosans superparamagnetic oxide iron nanoparticles，FA-OCMCS-SPIO-NPs)和羧甲基殼聚糖-SPIO-NPs(O-carboxymethyl chitosans superparamagnetic oxide iron nanoparticles，OCMCS-SPIO-NPs)的急性毒性，以及以葡聚糖-SPIO-NPs(dextran-superparamagnetic oxide iron nanoparticles，dextran-SPIO-NPs)為不能逃避肝、脾吞噬的陽性對照，評價2種造影劑的抗吞噬性，為將來動物體內的更深入研究打好基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器

HERMLE2360高速低溫離心機(美國Thermo Scientific公司)；超濾離心管(10 kD，德國Sartorius公司)；CLZ型恒溫磁力攪拌器(河南鞏義予華儀器廠)；SK5200HL型超聲粉碎儀(上海科導超聲儀器有限公司)；Sephacrys-300HR凝膠(美國Pharmacia公司)；透析袋(截留相對分子量8000～15000，上海源聚生物科技有限公司)。

1.2 試藥

FA-OCMCS-SPIO-NPs、OCMCS-SPIO-NPs和dextran-SPIO-NPs均由南方醫院藥學部科研組自制，含量以鐵濃度表示，分別為18.46、18.67、20.32 mg(Fe)·mL－1，經測定，3種納米粒的強均粒徑分別為41.4、38.2、125 nm。

FeCl3·6H2O、FeSO4·7H2O、氨水、無水乙醇、二甲苯、鹽酸、甲醛和亞鐵氰化鉀(廣州化學試劑有限公司)；0.5%伊紅溶液(凱基生物科技發展有限公司)；葡聚糖(分子量40000)、碳二亞胺(美國Sigma公司)；羧甲基殼聚糖(分子量10000～20000，脫乙酰化度≥93%，羧基取代度≥87%，青島海普生物技術有限公司)。

1.3 動物

SPF級KM小鼠，體重(20±2)g，購自南方醫科大學實驗動物中心，合格證號:SCXK(粵)2006-0015。

2 方法

2.1 3種納米粒的制備

2.1.1 OCMCS-SPIO-NPs的制備。取摩爾比2∶1的FeCl3·6H2O和FeSO4·7H2O，將二者溶解并混合，充氮攪拌下加適量氨水至pH約為11，升溫反應1 h后磁性分離，并水洗4次，加入30 g·L－1碳二亞胺的磷酸鹽緩沖溶液，超聲分散，轉入3%的羧甲基殼聚糖溶液中，超聲反應1 h，產物離心30 min，取上清液過葡聚糖凝膠柱，收集首峰，蒸餾水透析24 h，超濾濃縮備用[3]。

2.1.2 FA-OCMCS-SPIO-NPs的制備。取蒸餾水透析過的OCMCS-SPIO-NPs，加一半體積的無水乙醇，高速離心，沉淀用無水乙醇、二甲亞砜各洗3遍，無水二甲亞砜超聲分散備用。參考文獻[4]方法合成葉酸活性酯，充氮加熱下，將葉酸活性酯加入OCMCS-SPIO-NPs的無水二甲亞砜溶液中，反應4 h，產物蒸餾水透析24 h，超濾濃縮備用[2]。

2.1.3 dextran-SPIO-NPs的制備。將葡聚糖與摩爾比為2∶1的FeCl3·6H2O和FeSO4·7H2O充分混合，充氮攪拌下以堿性共沉淀法制備[5]。

2.2 急性毒性評價

取小鼠70只，分為空白組、FA-OCMCS-SPIO-NPs組和OCMCS-SPIO-NPs組，空白組10只，其它2組每組30只，♂♀各半。將2個給藥組內的小鼠再平均分成高、中、低3個劑量組，每組10只，♂♀各半。有研究[6]發現，尾靜脈給予昆明小鼠266.75 mg(Fe)·kg－1的SPIO-NPs后，出現短時少動現象，而最大給藥劑量(438.5 mg(Fe)·kg－1)下，小鼠仍未出現死亡。本實驗中SPIO-NPs經包被后理論上毒性會下降，故以278 mg(Fe)·kg－1為最低給藥濃度，以1∶0.8為組間距設計3個濃度梯度組(即278、347.5、434.5 mg(Fe)·kg－1)，尾靜脈一次性給藥后，觀察14 d內小鼠的死亡、飲食和體重變化情況。空白組尾靜脈注射0.5 mL生理鹽水，14 d后處死，觀察心、肝、脾、肺、腎并拍照。2個給藥組存活小鼠14 d后處死，從高、中、低3個劑量組中各取幾只小鼠解剖，觀察心、肝、脾、肺、腎并拍照。

2.3 抗吞噬性評價

在1.68～2.52 mg(Fe)·kg－1的給藥劑量下，超小SPIO-NPs(粒徑小于100 nm)在人體內的t1/2(24～36 h)遠高于動物(2～3 h)，故動物實驗多采用高劑量給藥(11.2～56 mg(Fe)·kg－1)[1]。為了考察小鼠肝、脾對造影劑的吞噬作用，本實驗中選取了較高的給藥劑量(約56 mg(Fe)·kg－1)進行考察。

取♂小鼠20只，分成4組，每組5只，分別從尾靜脈注射FA-OCMCS-SPIO-NPs(54.4mg(Fe)·kg－1)、OCMCS-SPIONPs(56.2 mg(Fe)·kg－1)、dextran-SPIO-NPs(57.6 mg(Fe)·kg－1)和生理鹽水(0.2 mL)。24 h后，全部脫頸椎處死，取肝和脾于4%福爾馬林溶液中固定24 h，石蠟包埋并做普魯士藍染色切片。以注射生理鹽水的小鼠為陰性對照組，注射dextran-SPIO-NPs的小鼠為陽性對照組，依據肝、脾吞噬的SPIO納米粒經普魯士藍染色后呈藍色來評價2種造影劑抗肝、脾吞噬的能力。如果合成的2種納米粒能逃避肝、脾的吞噬，則其與dextran-SPIO-NPs組相比，表現為染色后的切片上沒有或者只有零星少許藍色。

3 結果

3.1 急性毒性評價

FA-OCMCS-SPIO-NPs及OCMCS-SPIO-NPs的各給藥劑量組相關情況如表1和表2所示。

表1 FA-OCMCS-SPIO-NPs各給藥劑量組實驗結果Tab 1Tests results of FA-OCMCS-SPIO-NPs groups of different doses

表2 OCMCS-SPIO-NPs各給藥劑量組實驗結果Tab 2Test results of OCMCS-SPIO-NPs groups of different doses

由于FA-OCMCS-SPIO-NPs組和OCMCS-SPIO-NPs組的小鼠均未出現死亡，依據新藥臨床前研究指導原則[7]，2種納米粒的LD50＞434.5 mg(Fe)·kg－1，所有小鼠均未出現明顯的毒性反應。14 d后處死小鼠，解剖并觀察各組小鼠的心、肝、脾、肺、腎，與空白組相比均未發現明顯的組織損傷，詳見圖1、圖2。

圖1 給予OCMCS-SPIO-NPs 14 d后各給藥劑量組小鼠各組織照片Fig 1Pictures of each tissue in each group after mice are injected with OCMCS-SPIO-NPs with different doses for 14 days

3.2 抗吞噬性評價

各組小鼠肝、脾普魯士藍染色切片照片見圖3、圖4。

圖2 給予FA-OCMCS-SPIO-NPs 14 d后各給藥劑量組小鼠各組織照片Fig 2Pictures of each tissue in each group after mice are injected with FA-OCMCS-SPIO-NPs with different doses for 14 days

圖3、圖4中各組織切片照片上箭頭所指的點是被染成藍色的SPIO-NPs。從這些切片圖上可以清晰地看到粒徑大于100 nm的dextran-SPIO-NPs(圖3D、圖4D)無法逃避肝、脾中巨噬細胞的吞噬，而粒徑小于50 nm的FA-OCMCS-SPIO-NPs能完全逃避吞噬，OCMCS-SPIO-NPs則大部分逃避了吞噬。

4 討論

2種新型磁共振造影劑的急性毒性結果顯示，在最大給藥劑量下，小鼠均無明顯的毒性反應，表明其具有良好的安全性。FA-OCMCS-SPIO-NPs高劑量組中，小鼠表現出輕微的食欲減退，可能是由于嫁接葉酸以后納米粒的粒徑有所變大，毒性有所增加，也有可能是殘留溶劑二甲亞砜的影響。本實驗中SPIO-NPs包被以親水性材料羧甲基殼聚糖后，靜脈給藥劑量達434.5 mg(Fe)·kg－1時也沒有明顯的毒性反應，這可能是因為包被材料后，納米粒對體內細胞結構的破壞性減小，降低了超順磁氧化鐵的毒性。

粒徑小于100 nm的超順磁氧化鐵理論上可以逃避肝、脾的吞噬，達到全身分布的目的，這樣就可能對全身除肝、脾部位的腫瘤、血管及腫瘤淋巴結轉移進行造影，打破了傳統的超順磁氧化鐵只針對肝臟造影的現狀，具有重要的研究意義。通過實驗可知，2種磁共振造影劑均能逃避巨噬細胞豐富的肝、脾組織的吞噬。雖然肝、脾對OCMCS-SPIO-NPs有輕微的吞噬，但與dextran-SPIO-NPs相比，吞噬量很少，這與筆者之前體外評價巨噬細胞對FA-OCMCS-SPIO-NPs和OCMCSSPIO-NPs的吞噬結果相吻合[2，8]，這為今后考察二者的造影效果奠定了一定的基礎。同時，二者又可以作為腫瘤靶向治療的藥物載體[9]，故對其研究具有巨大的應用前景。

[1]Corot C，Robert P，Jean-Marc I，et al.Recent advances in iron oxide nanocrystal technology for medical imaging[J].Advanced Drug Delivery Reviews，2006，58(14):1471.

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[3]范彩霞，高文慧，陳志良，等.超小的羧甲基殼聚糖超順磁氧化鐵納米粒制備及處方優化[J].中國現代應用藥學，2010，27(9):825.

[4]Mansouri S，Cuie Y，Winnik F，et al.Characterization of folate-chitosan-DNA nanoparticles for gene therapy[J].Biomaterials，2006，27(9):2060.

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[6]王國斌，夏澤鋒，陶凱雄，等.醫用納米級Fe3O4磁流體的急性毒理學實驗研究[J].華中科技大學學報(醫學版)，2004，33(4):452.

[7]中華人民共和國衛生部藥政局.新藥(西藥)臨床前研究指導原則匯編(藥學、藥理學、毒理學)[S].1993:199.

[8]范彩霞，高文慧，陳志良，等.體外評價羧甲基殼聚糖超順磁氧化鐵納米粒的細胞毒性和巨噬細胞攝取[J].華西藥學雜志，2010，25(3):290.

[9]Sun C，Lee JS，Zhang M.Magnetic nanoparticle in MR imaging and drug delivery[J].Advanced Drug Delivery Reviews，2008，60(11):1252.