花椒RAPD-PCR反應體系的建立與優化Δ

宋麗，劉友平（1.成都中醫藥大學藥學院中藥材標準化教育部重點實驗室，成都市611137；2.成都醫學院藥學院，成都市 610083）

隨機擴增的多態性DNA（Random amplified polymorphic DNA，RAPD），是美國的Williams和Welsh兩個研究小組于1990年同時提出的一種以聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction，PCR）為基礎，運用隨機引物擴增，尋找多態性DNA片段的遺傳標記技術，具有快速、簡便、成本低、DNA用量少、應用范圍廣等優點[1]。

花椒（Zanthoxyli Pericarpium）為蕓香科花椒屬植物青椒（Zanthoxylum schinifoliumSieb.et Zucc.）或花椒（Z.bungeanumMaxim.）的干燥成熟果皮，具有“溫中止痛，殺蟲止癢”的功效[2]。花椒為川產道地藥材，甘孜、阿壩、涼山州等地均有栽培，但各地藥材質量存在差異[3]，因此有必要研究不同產地花椒與青椒的遺傳多樣性，為花椒的鑒定、選種提供依據。由于目前還未見有關花椒與青椒RAPD-PCR分析方面的報道，因此本文所建立的反應體系可為花椒與青椒的遺傳多樣性研究打下良好基礎。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

MyCycler型梯度PCR儀、Geldoceq型紫外凝膠成像分析儀（美國Bio-Rad公司）；TGL-16G型高速離心機（上海嘉鵬科技有限公司）；HB-100型恒溫金屬?。ê贾莶┤湛萍加邢薰荆?；DYY-Ⅲ2型穩壓穩流電泳儀（北京市六一儀器廠）；MDF-U50V型超低溫冰箱（日本Sanyo公司）。

1.2 試藥

花椒采自四川省內花椒（Z.bungeanumMaxim.）、青椒（Z.schinifoliumSieb.et Zucc.）的嫩葉或嫩芽?；ń返漠a地見表1。樣品采集后，立即裝入放有干燥劑變色硅膠的封口袋內，于4℃貯藏，備用。十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、核糖核酸酶A（RNase A）、瓊脂糖、DNA Maker DL 15 000、三磷酸脫氧核糖核苷酸（dNTPs）、Taq聚合酶、DNA Maker DL 2000（大連寶生物工程有限公司）；隨機引物（北京賽百盛基因技術有限公司）；聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、β-巰基乙醇、氯仿、異戊醇、異丙醇、乙醇、氯化鈉（成都市科龍化工試劑廠）。

表1 花椒的產地Tab 1 The habitat of Zanthoxyli.pericarpium

2 方法與結果

2.1 DNA的提取

采用CTAB法提取總DNA。取樣品約50 mg，加入少量石英砂和PVP粉，于－80℃超低溫冰箱中放置過夜?？焖傺心コ杉毞?，轉移到干凈滅菌的1.5 mL Eppendorf（EP）管中，加入65℃預熱的3%CTAB緩沖液700 μL和β-巰基乙醇50 μL，混勻，置65℃金屬浴中，約10 min震蕩1次。冷至室溫，加等體積的氯仿-異戊醇（24∶1）抽提2次，每次抽提后10 000 r·min-1離心10 min，將水相轉移到另一干凈滅菌的1.5 mL EP管中。加入1/2體積5 mol·L-1的NaCl溶液和等體積預冷至－20℃的異丙醇，輕輕顛倒混勻，置于－20℃冰箱中沉淀1 h。10 000 r·min-1離心10 min，小心傾去上清液，用70%乙醇50 μL洗滌2次，每次洗滌后10 000 r·min-1離心2 min，倒置于濾紙上自然干燥1 h。加入50 μL ddH2O，置于37℃金屬浴中0.5 h溶解。加入1 μg·μL-1的RNase A 2 μL，置于37 ℃金屬浴中水解1 h。冷至室溫，4℃貯藏，備用。

考察提取時間30、45、60 min，均可獲得足夠的DNA用于PCR，故采用提取時間為30 min。DNA提取時間的優化見圖1。

圖1 DNA提取時間的優化Fig 1 The optimization of DNAextracting time

2.2 DNA的檢測

采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測總DNA。取DNA樣品5 μL，與6×Loading Buffer 1 μL混勻后點于凝膠孔中，與3 μL DNA Maker DL 15 000同置1×TAE緩沖液中，于100 V電壓下電泳，紫外成像檢測。

2.3 PCR體系

考察MgCl2、dNTPs、引物、模板DNA和Taq酶5個因素，每個因素取4個濃度水平，采用正交設計進行優化。因素水平見表2；正交試驗結果見表3。

表2 因素水平Tab 2 Factors and levels

表3 正交試驗結果Tab 3 Results of orthogonal experiment

11號試驗方案可獲得清晰、穩定的PCR擴增條帶，故在25 μL反應體系中應加入ddH2O 13.5 μL、25 mmol·L-1的 MgCl22.0 μL、2.5 mmol·L-1的 dNTPs 2.0 μ L、10 ×Buffer 3.0 μL、10 ng·μL-1的引物2.0 μL、模板DNA2.0 μL和 5 IU Taq 酶 0.5 μL。PCR體系的優化見圖2。

圖2 PCR反應體系的優化Fig 2 The optimization of PCR reaction system

圖3 退火溫度的優化Fig 3 The optimization of renaturation temperature

圖4 循環次數的優化Fig 4 The optimization of circulation number

2.4 PCR程序

考察退火溫度和循環次數，43.8℃的退火溫度和45次循環可獲得清晰、穩定的PCR擴增條帶，故PCR程序為95℃預變性3 min，94℃預變性2 min，94℃變性50 s，43.8 ℃退火1 min，72 ℃延伸 1 min 20 s，45 個循環，72℃最后延伸5 min。退火溫度的優化見圖3；循環次數的優化見圖4。

2.5 擴增產物的檢測

采用1.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。取擴增產物 5.0 μL，與 6×Loading Buffer 1.0 μL混勻后點于凝膠孔中，與 3.0 μL DNA Maker DL 2 000同置1×TAE緩沖液中于100 V電壓下電泳，紫外成像檢測。

2.6 RAPD-PCR體系的穩定性考察

按“2.3”、“2.4”項下方法操作，對表1中的花椒樣品進行PCR擴增，均可獲得清晰、穩定的PCR擴增條帶?；ń放c引物TGCTCTGCCC擴增產物的電泳圖見圖5。

3 討論

圖5 花椒與引物TGCTCTGCCC擴增產物的電泳圖Fig 5 Electrophoretogram of amplified products of Zanthoxyli Pericarpium and primer TGCTCTGCCC

花椒中的雜質如多糖、多酚、蛋白質等會影響DNA的提取、純化以及PCR擴增，因此筆者以往參考文獻[4]采用改良的CTAB法提取DNA，并加入石英砂增加植物細胞壁的破碎，加入氯仿-異戊醇（24∶1）抽提蛋白質，加入PVP、β-巰基乙醇和 5 mol·L-1的 NaCl除去多糖、多酚等雜質[4，5]。此外，由于RAPD反應對DNA的質量要求不高，因此在加入少量Rnase酶除去RNA后，不再抽提蛋白質，試驗證明，這樣可減少DNA的損失，并且不影響PCR擴增。

RAPD反應的影響因子較多，反應體系中Mg2+、dNTP、模板DNA、引物，Taq聚合酶等的濃度直接影響著試驗結果的準確性和重復性，若是每項一一考察，不僅操作煩瑣，而且耗費大量的時間和試驗經費，因此本文采用正交試驗考察各影響因子，大大簡化了試驗過程，節約了時間和經費。此外，PCR的各成分之間的濃度比例是一個動態過程，反應體系中改變某成分的濃度時相應改變其他成分的濃度才能有效擴增，因此通過正交試驗可得到多種有效組合，有利于根據試劑情況選用不同的組合[6]。

[1] 白 音，包英華，王文全，等.美花石斛RAPD-PCR反應體系的建立[J].時珍國醫國藥，2007，18（3）：521.

[2] 國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（一部）[S].2010年版.北京：中國醫藥科技出版社，2010：149.

[3] 徐國鈞，徐珞珊，王崢濤.常用中藥材品種整理和質量研究（第3冊）[M].福州：福建科學技術出版社，2001：532.

[4] 童巧珍，周日寶，劉湘丹，等.藥用百合鱗葉中總DNA提取方法的研究[J].中國藥房，2008，19（6）：406.

[5] 王 婷，李愛賢，郭慶梅，等.忍冬葉片基因組DNA的提取與分析[J].山東中醫藥大學學報，2008，32（3）：247.

[6] 李勁平，王培訓.正交設計在RAPD-PCR條件優化中的應用[J].中藥新藥與臨床藥理，2004，15（4）：265.