黑龍江省部分地區(qū)鵝致病性大腸桿菌血清型鑒定及藥敏試驗(yàn)

趙 陽，王藝萌，張文龍，馬 波，王君偉

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

我國是世界上養(yǎng)鵝數(shù)量和鵝食品消費(fèi)量最多的國家。隨著集約化養(yǎng)殖的普及，鵝致病性大腸桿菌對養(yǎng)鵝業(yè)的危害和導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失日益嚴(yán)重，成為目前危害養(yǎng)鵝業(yè)傳染病之一。

鵝大腸桿菌病是由致病性大腸埃希氏桿菌所引起的一種傳染病，不同品種和日齡的鵝均可發(fā)病，但仔鵝最易感。在臨床上主要表現(xiàn)為敗血癥、纖維素性氣囊炎、肝周炎、心包炎和腹膜炎。近年來，隨著抗菌藥物的大量應(yīng)用，耐藥菌株不斷出現(xiàn)，鵝大腸桿菌病的發(fā)生有逐年上升的趨勢，部分地區(qū)鵝大腸桿菌病的流行情況已比較嚴(yán)重。

本試驗(yàn)從黑龍江省部分地區(qū)中分離了鵝致病性大腸桿菌，并對鑒定出的大腸桿菌進(jìn)行血清型分析和藥敏試驗(yàn)，為了解鵝大腸桿菌病在本省的流行情況，指導(dǎo)用戶選擇合適的治療藥物以及制定科學(xué)的防治措施提供部分參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 麥康凱培養(yǎng)基、普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、馬丁肉湯培養(yǎng)基，伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基，均購自北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司。微量發(fā)酵管，藥敏紙片均購自杭州天和微生物試劑有限公司，大腸桿菌抗O1～O163因子血清，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀察 將病料無菌劃線接種于麥康凱平板上，37℃培養(yǎng)24h。挑取麥康凱平板上的紅色單菌落進(jìn)行革蘭染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.2 生化試驗(yàn) 挑取革蘭陰性短桿菌的單菌落在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行純培養(yǎng)后，按說明書接種微量生化管。

1.2.3 血清型測定 取大腸桿菌試管斜面培養(yǎng)物劃線接種麥康凱瓊脂平板，37℃培養(yǎng)24h。挑取平板上光滑、圓整的單個(gè)紅色菌落，接種普通瓊脂斜面和液體肉湯培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h，培養(yǎng)期間肉湯振蕩數(shù)次。用0.5%石炭酸生理鹽水1.5mL洗下普通瓊脂斜面培養(yǎng)物，置小試管中，與肉湯小瓶培養(yǎng)物一起于121℃高壓2h。取小試管的高壓抗原分別與大腸桿菌多價(jià)血清、單因子血清進(jìn)行平板凝集反應(yīng)。小試管用于平板凝集，肉湯小瓶抗原用于試管凝集。

血清型鑒定按中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供的產(chǎn)品使用說明書進(jìn)行操作。所有分離株首先經(jīng)平板凝集試驗(yàn)初步篩選出可能的O血清型，然后通過試管凝集試驗(yàn)確定其O血清型。定型標(biāo)準(zhǔn)為血清的試管凝集價(jià)不小于1∶640。每次試驗(yàn)同時(shí)以高壓抗原與0.5%苯酚生理鹽水混合物作對照，觀察有無自凝現(xiàn)象。3min內(nèi)出現(xiàn)凝集者為陽性反應(yīng)。

1.2.4 藥敏試驗(yàn) 將分離到的61株大腸桿菌在無菌條件下分別接種肉湯培養(yǎng)基，然后放入搖床中培養(yǎng)6h后計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)菌液的含菌量為108個(gè)／mL。按常規(guī)紙片法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng) 經(jīng)37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后，在麥康凱瓊脂平板上形成紅色的大小中等菌落。挑取單個(gè)紅色單菌落劃線接種于在普通瓊脂平板上純培養(yǎng)后，形成表面光滑、濕潤、半透明、灰白色、圓形微凸起，中等大小的菌落。在伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上呈黑紅色并有金屬光澤。革蘭染色鏡檢可見兩端純圓、多數(shù)散在排列，革蘭陰性短桿菌。

2.2 生化試驗(yàn) 發(fā)酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇，對蔗糖的發(fā)酵因菌株而異，產(chǎn)生靛基質(zhì)，不分解尿素，不產(chǎn)生硫化氫，甲基紅陽性，V-P陰性，檸檬酸鹽陰性，均符合大腸桿菌的特性。

2.3 血清型的鑒定結(jié)果 61株鵝致病性大腸桿菌血清型鑒定結(jié)果見表1，各血清型的地區(qū)分布見表2。分離出的61株大腸桿菌，除3株因未出現(xiàn)玻板凝集反應(yīng)或自凝而未能定型外，其余58株分屬21個(gè)血清型。O9、O18、O64、O93共計(jì)32株，占全收集52.46%（32／61），11個(gè)地區(qū)分離到 O9、O18、O64、O93血清型，占全分離地區(qū)的69%（11／16），這4種血清型在黑龍江省內(nèi)分布廣泛，為優(yōu)勢血清型。其他分離出的血清型見表1。大腸桿菌的血清型分布比較分散，各地區(qū)分布無明顯規(guī)律性。

表1 61株鵝致病性大腸桿菌分離株的血清型

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 藥敏試驗(yàn)結(jié)果見表2，表明，分離菌株呈現(xiàn)出不同程度的耐藥性，61株大腸桿菌對氧氟沙星和復(fù)達(dá)欣高敏比例分別為57%和51%，復(fù)方新諾明、先鋒噻肟和氯霉素次之，分別為38%、34%和33%，氨芐青霉素、頭孢呋肟、卡那霉素不足10%，四環(huán)素對所分離的菌株無抑制作用。氨芐青霉素、妥布霉素、阿米卡星、慶大霉素的耐藥率高于66%，因此不建議應(yīng)用于臨床。大腸桿菌對10種藥物的耐藥率在50%以上，占所檢藥物的56%。耐藥率低于33%的僅有3種，分別是先鋒噻肟，復(fù)達(dá)欣，菌必治。

3 討論

3.1 鵝致病性大腸桿菌血清型特點(diǎn) 對黑龍江省部分地區(qū)鵝致病性大腸桿菌的血清型鑒定結(jié)果表明，鵝場中致病性大腸桿菌的主要血清型是O9、O18、O64、O93共計(jì)32株，占全部收集52.46%（32／61），占全部調(diào)查區(qū)域的69%，是優(yōu)勢血清型。混合血清型 O8／O60，O13／O14，O18／O158，O101／O162在鵝首次分離到。近年來，多種大腸桿菌混合型的出現(xiàn)，在大腸桿菌病的防治上應(yīng)引起重視。有關(guān)致病性大腸桿菌血清型鑒定國內(nèi)外報(bào)道較多，各地區(qū)流行的優(yōu)勢血清型相差比較大。國外有研究報(bào)道，禽致病性大腸桿菌常見血清型為 O1、O2、O35、O78［1］，本次試驗(yàn)則分離出此4個(gè)主要血清型。國內(nèi)血清型多且地區(qū)差異大［2-3］。雖然各地區(qū)血清型有部分交叉，但未發(fā)現(xiàn)規(guī)律性。本試驗(yàn)對61株大腸桿菌血清型的鑒定為黑龍江地區(qū)大腸桿菌病的防制提供了參考。優(yōu)勢血清型的出現(xiàn)，為研制有效的疫苗提供了科學(xué)的依據(jù)［4］。

3.2 黑龍江省鵝致病性大腸桿菌耐藥譜的變化大腸桿菌易產(chǎn)生耐藥性，可由染色體或質(zhì)粒介導(dǎo)，它可以通過菌毛將耐藥質(zhì)粒傳遞給其他大腸桿菌［5］。臨床常用的慶大霉素，氨芐青霉素，氟哌酸對分離的61株鵝致病性大腸桿菌抑菌作用較低，而妥布霉素，四環(huán)素，阿米卡星類對所分離的菌株幾乎無抑制作用。細(xì)菌耐藥性的發(fā)生和發(fā)展正是抗菌藥物廣泛應(yīng)用，特別是無指征濫用的結(jié)果。極低的高敏率說明，多數(shù)藥物對大腸桿菌的治療效果一般，同時(shí)也易發(fā)生耐藥性的惡化。

表2 61株鵝致病性大腸桿菌對18種抗生素的藥敏

耐藥率低于33%的僅有3種，分別是先鋒噻肟，復(fù)達(dá)欣，菌必治，以上3種藥物可以作為臨床治療的候選藥物。所以在用藥上，應(yīng)遵循盡量窄譜的原則，能用窄譜的抗生素就不選用廣譜抗生素，而且要先進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，后用藥，做到有的放矢，減少無故的耐藥性產(chǎn)生。而且要注意，大腸桿菌用藥一定要量足，因?yàn)榇竽c桿菌的繁殖非常快，大約18min就能繁殖一代，這樣是避免體內(nèi)藥物濃度不足產(chǎn)生的耐藥性變異。注意進(jìn)行細(xì)菌耐藥性的監(jiān)測，在有限的條件下盡量避免耐藥菌株的產(chǎn)生。多數(shù)菌株多重耐藥嚴(yán)重，多重耐藥菌株甚至出現(xiàn)了18耐的情況，13耐、14耐、16耐也不在少數(shù)。所以，交叉用藥的方法也已經(jīng)不可取了。所以，針對大腸桿菌耐藥性的解決應(yīng)是以后的重點(diǎn)。

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