消毒劑誘導大腸桿菌質控菌耐藥與抗菌藥物耐藥相關性試驗

張 靜，吳開菊，馬保瑞，吳俊偉

（西南大學動物醫學系，重慶 榮昌 402460）

1 材料與方法

1.1 藥品 恩諾沙星，含量為99.8%，批號：1002272；磺胺二甲氧嘧啶鈉，含量為98.4%，批號：20100304；土霉素，含量為87.4%，批號：20100410；慶大霉素，含量為624.6IU／mg，批號：10012031；硫酸粘菌素，含量為98%，批號：0809051；苯扎溴銨，含量為0.85%～0.95%，批號：091101。均由重慶方通動物藥業有限公司提供。

1.2 菌株 大腸桿菌ATCC25922，購自中國獸醫藥品監察所。

1.3 培養基及試劑 營養肉湯培養基，北京陸橋技術有限責任公司，批號：100121；麥糠凱瓊脂培養基，北京陸橋技術有限責任公司，批號：100310；氫氧化鈉，成都東金化學試劑有限公司，批號：20100305。

1.4 體外抑菌試驗 根據5種抗菌藥物的理化性質，用適宜的溶劑溶解后，配成5120μg／mL的標準儲備液，過濾除菌后，分裝于滅菌的離心管中，于-20℃保存備用。苯扎溴銨用無菌水配成0.1%儲備液，過濾除菌后于-20℃保存備用。

操作方法：以恩諾沙星為例，采用試管二倍稀釋法進行，將培養過夜的菌液用肉湯做10倍稀釋，恩諾沙星溶液做10倍稀釋。取滅菌試管排列在試管架上，經紫外線照射后，在每只試管內加入2mL營養肉湯，在第一支試管內加入2mL恩諾沙星溶液，用移液器吹吸混勻后，吸出2mL至第2支試管，依次做倍比稀釋，至第7管混勻后棄去2mL，此時，恩諾沙星的濃度依次為256、128、64、32、16、8、4μg／mL。

每組設陽性對照（菌液對照）、陰性對照（藥液對照）、空白對照（肉湯對照）3個對照，用微量移液器取100μL稀釋后的菌液，依次加入倍比稀釋的含藥試管以及菌液對照管中，使最終接種菌量為5×105CFU／mL。每種藥物做雙樣品測定，以無菌生長的最低濃度為最低抑菌濃度。若第一次試驗未能測出相應的MIC，則適當擴大藥物稀釋濃度。

1.5 亞抑菌濃度苯扎溴銨誘導大腸桿菌質控菌耐藥 根據苯扎溴銨的 MIC，配制1／2×MIC、1×MIC、2×MIC、4×MIC、8×MIC、16×MIC、32×MIC、64×MIC、128×MIC含藥麥糠凱瓊脂培養基，在含1／2×MIC藥物濃度的麥康凱培養基接種適量培養物（約105CFU），37℃培養24h，挑選生長良好的菌落，接種于1×MIC誘導劑的培養基37℃培養24h，以此類推，逐漸提高培養基中誘導劑的濃度直到誘導前MIC的128倍［1］。誘導耐藥的大腸桿菌質控菌為ATCC25922YD。

1.6 受試藥品對誘導耐藥后的大腸桿菌質控菌的最小抑菌濃度測定 同樣采用試管二倍稀釋法，以無菌生長的最低濃度為最低抑菌濃度。

2 結果與分析

2.1 體外抑菌試驗 0.1%苯扎溴銨作體外抑菌試驗，測得MIC為0.125μg／mL，而恩諾沙星、慶大霉素、硫酸粘菌素、磺胺二甲氧嘧啶鈉和土霉素的MIC分別為2μg／mL、1μg／mL 、32μg／mL、0.25 μg／mL和1μg／mL。

2.2 亞抑菌濃度苯扎溴銨誘導大腸桿菌質控菌耐藥 采用平板劃線培養，以1／2×MIC苯扎溴銨濃度為起始點開始誘導，成功誘導到128×MIC。獲得了對苯扎溴銨高度耐藥的大腸桿菌誘導菌株ATCC25922YD。

2.3 誘導后的大腸桿菌體外抑菌試驗 結果見表1。

表1 誘導前后5種抗菌藥物對大腸桿菌質控菌ATCC25922的 MIC （μg／mL）

由表1可以看出，經亞抑菌濃度苯扎溴銨誘導耐藥的大腸桿菌ATCC25922磺胺二甲氧嘧啶鈉、土霉素產生高水平耐藥，其中土霉素的MIC擴大了500倍；而對恩諾沙星及慶大霉素的MIC變化維持在2～4倍；對硫酸粘菌素的MIC沒有影響。

3 討論

3.1 亞抑菌濃度的消毒劑能誘導細菌產生耐藥亞抑菌濃度的抗菌藥物可以誘導細菌耐藥［2］，在低濃度消毒劑持續作用下，細菌的自身耐受性會發生變化，從而產生生理適應性耐藥。班海群［3］報道，當細菌長期處于低濃度消毒劑作用下，會增加細菌的基因突變率，引起消毒劑靶位改變、外排泵系統上調或下調、膜孔蛋白丟失等。以上因素均會使細菌對亞抑菌濃度下的消毒劑產生耐藥性。

3.2 消毒劑誘導菌株對抗菌藥物產生耐藥 早在1993年Levy等［4］報道，在含2～5mg／L四環素或5～10mg／L氯霉素平板上連續劃線培養，可以得到同時對四環素、氯霉素、青霉素、利福平等多種抗生素的多重耐藥菌株，但由消毒劑誘導的對抗菌藥物的多重耐藥菌未見報道。細菌對抗菌藥物和消毒劑的耐藥機制有相似之處，許多介導細菌消毒劑耐藥的機制同樣可介導細菌對抗菌藥物產生耐藥，如主動外排泵表達亢進、膜通透性改變、滲透性改變等。由表1可以看到，對苯扎溴銨高度耐藥的大腸桿菌ATCC25922YD，對抗菌藥物同樣產生了不同水平的耐藥。

3.3 外排泵介導的細菌耐藥機制 細菌的外排系統是一種非特異性耐藥機制，它是由藥物主動外排泵來完成的。藥物外排泵是一類位于細胞膜上的具有特殊結構的膜轉運蛋白，當細胞內的藥物濃度聚集達到一定數值時，藥物外排泵相關mRNA的表達量增加，使細胞膜上外排泵的數量增加，使藥物泵出菌體，從而加強細菌在藥物選擇壓力下的生存能力，產生耐藥。細菌主動外排泵系統一般由3部分組成：外膜通道蛋白、融合蛋白和胞質膜外排蛋白。大腸桿菌是發現外排泵最多的一種細菌，一般認為AcrAB-Tolc是最主要的外排泵，且此外排泵底物廣泛，可以外排吖啶橙、結晶紫、溴乙啶、鐮孢菌酸、四環素、氯霉素、新霉素、紅霉素、夫西地酸、SDS、萘啶酸、氯比西林、氟喹諾酮類、β-內酰胺類、利福平、吐溫X-100等多種制劑［5］。本試驗結果顯示，經誘導的大腸桿菌對氟喹諾酮類藥物及磺胺類藥物均產生了耐藥，這可能是可以外排消毒劑的大腸桿菌外排泵AcrAB-Tolc高水平表達，而此外排泵底物廣泛，同時又可以外排一些抗菌藥物所致。而四環素類抗菌藥土霉素產生了高水平耐藥，但對氟喹諾酮類藥物恩諾沙星的最小抑菌濃度變化只有2倍，這可能與四環素類藥物存在另外的外排系統Tet有關［5］。經誘導的大腸桿菌對硫酸粘菌素并未產生耐藥，硫酸粘菌素的作用機制［6］不同于其他抗菌藥物，硫酸粘菌素首先吸附在細菌細胞膜，結合細胞膜中脂蛋白的游離磷酸鹽，引起細胞膜的結構改變或破損，導致細菌死亡。所以經亞抑菌濃度的消毒劑誘導而得的大腸桿菌ATCC25922YD并未對其產生耐藥。

3.4 消毒劑與抗菌藥物濫用與細菌耐藥的相關性消毒劑廣泛應用在醫院、養殖場以及食品加工廠等場所，日趨多樣的應用空間以及缺乏科學的使用常識，會使細菌通過誘導耐藥的方式對消毒劑產生耐藥性，繼而引發對抗菌藥物的耐藥。反之，由于消毒劑與抗菌藥物存在某些共同作用靶點與耐藥機制，長期濫用抗生素很可能也會造成對消毒劑的耐藥性。提示在細菌耐藥性嚴重的今天，醫院和養殖場等場所長期不科學使用消毒劑將對解決細菌耐藥帶來新的困難，應引起高度重視。

［1］張海旺，鄧旭明，張煜，等.大腸桿菌耐藥株的體外誘導及其acrA和 marA基因分析 ［J］.中國預防獸醫學報，2005，27（6）：553-557.

［2］Michea-Hamzehpour M，Kahr A，Pechere J C.In vitro stepwise selection of resistance to quinolo-nes，β-lactams and amikacin in nosocomial Gramnegative bacilli［J］.Infection，1994（Suppl 2）：105.

［3］班海群，李新武，張流波.消毒劑的使用對細菌耐藥的潛在影響［J］.中國消毒學雜志，2008，25（3）：308-312.

［4］Cohen S P，Hachler H，Levy S B.Genetic and functional analysis of the multiple antibiotic resistance （mar）locus inescherichia coli［J］.J Bacteriol，1993，175（5）：1484-1492.

［5］Paulsen I T，Skurray R A，Tametal R.The SMRfamily：a novel family of multidrug efflux protein in volved with the efflux of lipophilidrugs［J］.MolMicrobiol，1999，19：1175.

［6］王志祥，王成章，李曉峰，等.不同組合劑量黃霉素和硫酸抗敵素對肉仔雞飼喂效果的影響［J］.飼料工業，2000，21（6）：42-43.