微流控芯片非接觸電導檢測法測定溴吡斯的明片中溴吡斯的明的含量Δ

蔡自由，李永沖，陳纘光（.廣東食品藥品職業學院，廣州市50520；2.中山大學藥學院，廣州市50006）

溴吡斯的明（Pyridostigmine bromide）是一種有效的膽堿酯酶抑制藥。文獻報道的有關溴吡斯的明片含量測定的方法有紫外-可見分光光度法[1]、高效液相色譜（HPLC）法[2～5]等。紫外-可見分光光度法的選擇性相對較低；HPLC法分析成本高、樣品處理較煩瑣，且流動相多為有毒溶劑。采用微流控芯片分析目前國內、外尚未見報道。筆者采用微流控芯片非接觸電導檢測法[6]測定溴吡斯的明片中溴吡斯的明的含量，與傳統方法相比具有簡便快速、樣品前處理簡單、重復性好的特點，為其檢測提供了一種比較方便、準確、有效的新方法。

1 儀器與試藥

PMMA十字通道芯片（大連理工大學微系統研究中心，微通道上寬30 μm，下寬100 μm，深30 μm，進樣通道為十字結構，分離通道長44 mm，有效分離長度43 mm）；微型壓電陶瓷高壓電源（自制）[7]；非接觸電導檢測器（自制）[6]；SHZ-D（Ⅲ）型循環水式真空泵（鞏儀市英峪予華儀器廠）；色譜工作站（中山大學醫藥儀器與應用研究所），數據記錄與處理在普通P4微機上完成。

溴吡斯的明對照品（海南凱健制藥有限公司，純度＞99.99%）；溴吡斯的明片（上海中西三維制藥有限公司，批號：20090606、20101004、20101005、20101006，規格：60 mg）；2-（N-嗎啉代）乙磺酸（MES）（香港AMRES公司）；三（羥甲基）氨基甲烷（Tris）（Farca Chemical Supplies，優級純）；水為二次蒸餾水，其他試劑均為國產分析純。

2 方法與結果

2.1 試驗條件

緩沖體系：1 mmol·L－1HAc+1 mmol·L－1NaAc（pH 4.5）；分離電壓：1.80 kV；進樣時間：10.0 s；不加添加劑；非接觸電導檢測器激發電壓：60 V（Vp-p），頻率：60 kHz。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 準確稱取溴吡斯的明對照品0.010 0 g，用二次蒸餾水溶解并定容于10 mL容量瓶中，得1.00 mg·mL－1溴吡斯的明對照品溶液，4℃下保存，臨用時稀釋成各濃度的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取溴吡斯的明片20片，精密稱定，研細，精密稱取適量（約相當于溴吡斯的明0.012 g），置于200 mL容量瓶中，加水約100 mL，充分振搖使溴吡斯的明溶解，用水稀釋至刻度，搖勻，濾過，得溴吡斯的明片供試品溶液。

2.3 線性關系考察和檢出限

制備濃度為 1.0～200 μg·mL－1的系列對照品溶液，按“2.1”項下試驗條件測定。以溴吡斯的明峰面積（Y）為縱坐標，質量濃度（X，μg·mL－1）為橫坐標，得線性方程Y＝1 887.8X－1 241.3（r＝0.999 7）。結果表明，溴吡斯的明質量檢測濃度在10～100 μg·mL－1范圍內與峰面積積分值呈良好線性關系，檢出限為0.6 μg·mL－1（S/N＝3）。

2.4 精密度試驗

準確吸取1.00 mg·mL－1溴吡斯的明對照品溶液5.00 mL，加水稀釋100 倍，得50 μg·mL－1溴吡斯的明對照品溶液，重復進樣6次，按“2.1”項下試驗條件測定。結果，溴吡斯的明峰面積的RSD＝1.9%，表明儀器精密度良好。

2.5 穩定性試驗

按“2.2.2”項下方法制備溴吡斯的明供試品（批號：20090606）溶液，4 ℃下保存，按“2.1”項下試驗條件，分別于0、2、4、6、8 h進樣測定。結果，溴吡斯的明峰面積RSD＝2.0%，表明測定液在4℃下放置8 h內穩定。

2.6 加樣回收率試驗

精密量取溴吡斯的明片供試品（批號：20101005）溶液（59.5 μg·mL－1）5.00 mL 3份，分置于10 mL容量瓶中，分別按供試品含量的80%、100%、120%加入溴吡斯的明對照品溶液（1.00 mg·mL－1）238、298、358 μL，加水稀釋并定容至10.0 mL，分別進樣3次，測定結果見表1。

表1 加樣回收率試驗結果（n＝3）Tab 1 Results of content determination of PBT samples（n＝3）

2.7 樣品含量測定

取溴吡斯的明供試品（批號：20090606）溶液和對照品溶液適量，分別進樣，記錄電泳圖（見圖1）。結果，電泳譜圖基本一致，說明供試品輔料不出峰，對本法測定溴吡斯的明不干擾，故未設陰性對照。

圖1 芯片毛細管電泳譜圖Fig 1 Capillary electrophotogram of microfluidic chip

取3批供試品（批號：20101004，20101005，20101006）溶液適量，分別進樣，記錄電泳圖，根據“2.3”項下線性方程計算出溴吡斯的明片含溴吡斯的明（C9H13BrN2O2）的標示量，結果見表2。

表2 溴吡斯的明片樣品含量測定結果Tab 2 Results of recovery test

3 討論

3.1 緩沖溶液

筆者考察了不同緩沖體系對溴吡斯的明分離檢測的影響。結果發現，在MES-Tris、Tris-HC1、Tris-HAc、Tris-H3BO3、檸檬酸-檸檬酸鈉、三乙胺-H3PO4等緩沖溶液中，溴吡斯的明不出峰，其原因可能是上述各種緩沖液的電導與樣品的電導相差不大導致；在MES-His、Tris-His等緩沖溶液中出峰高，但與水峰或雜峰相連；在二乙胺-H3PO4、NaH2PO4-Na2HPO4等緩沖體系中出峰高，但峰形不好，且與雜峰相連；在三乙胺-H3BO3、HAc-NaAc、二乙胺-H3BO3、硼砂-H3BO3等緩沖體系中出峰高，且峰形和分離度都較好。綜合考慮峰形、峰高、分離度、基線和噪聲等因素，選擇了HAc-NaAc緩沖體系，如圖2所示。

圖2 溴吡斯的明在不同緩沖溶液中的芯片毛細管電泳譜圖Fig 2 Capillary electrophotogram of PB in different buffer solutions

試驗還考察了HAc和NaAc濃度和配比的影響。結果發現，隨著總體濃度的增大，電流也隨著增大，焦耳熱效應使基線噪聲也隨之增加；HAc和NaAc配比不同，緩沖體系pH會影響溴吡斯的明出峰的峰形和峰高。在c（HAc）∶c（NaAc）＝1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、2∶1、2∶2、2∶3、2∶4、3∶1、3∶2、3∶3、3∶4、4∶1、4∶2、3∶4和4∶4 mmol·L－1的緩沖體系中，都能實現溴吡斯的明分離。綜合考慮峰形、峰高、分離度、基線和噪聲等因素，優化選擇1 mmol·L－1HAc+1 mmol·L－1NaAc（pH 4.5）作為緩沖體系。

3.2 添加劑

考察了不同種類的添加劑，如甲醇、乙醇、十二烷基硫酸鈉（SDS）、β-環糊精（β-CD）等不同加入量對分離檢測（噪聲、拖尾因子、靈敏度和分離度）的影響。結果發現，加入0.1～0.5 mmol·L－1SDS對靈敏度有提高，但遷移時間明顯縮短，樣品峰與雜峰相連，隨著其濃度的增加，離子強度增大，電滲流亦增大，遷移時間變得更小，而且噪聲隨之增大，基線漂移亦隨之明顯。加入體積分數1～10%甲醇和1～10%乙醇，遷移時間隨體積分數增加而增大，檢測靈敏度隨之降低。加入β-CD 0.1～1.0 mmol·L－1對分離檢測無改善。綜合分離檢測效果，優化選擇不加添加劑。

3.3 分離電壓

試驗考察了分離電壓（1.00 kV～3.00 kV）對分離和檢測的影響。結果發現，隨著分離電壓的升高，樣品出峰時間縮短，電流增大，噪聲也增大。升高分離電壓，遷移時間明顯縮短，有利于加快分析速度，但樣品峰逐漸與雜峰相連，分離度變差，不利于分離；同時，電流增大，焦耳熱亦增大，會導致噪聲大幅度增加。綜合考慮分離度、峰形、噪聲等因素，優化選擇分離電壓為1.80 kV。

3.4 進樣時間

在其他因素相同的條件下，考察了進樣時間對分離和檢測的影響。結果表明，進樣時間在5.0 s～20.0 s范圍，當進樣時間延長時，峰高與峰面積呈增大趨勢。但當進樣時間超過15.0 s后，峰高增加的幅度減少，分離效果變差，而且隨著進樣時間的增加，一些不利因素如峰展寬和峰形拖尾等影響變得顯著。綜合考慮，優化的進樣時間為10.0 s。

綜上所述，微流控芯片非接觸電導檢測法測定溴吡斯的明片中溴吡斯的明的含量，方法簡便快速，重復性好，可用于溴吡斯的明片的質量控制。

[1] 國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（二部）[S].2005年版.北京：化學工業出版社，2005：820.

[2] 國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（二部）[S].2010年版.北京：中國醫藥科技出版社，2010：1 090.

[3] 王麗君，王東凱，黎 玲，等.溴吡斯的明注射液的制備及其含量測定[J].中國新藥雜志，2007，16（11）：881.

[4] 付文煥，施孝金，李中東，等.人血漿中溴吡斯的明濃度的RP-HPLC測定法[J].中國藥學雜志，2007，42（12）：924.

[5] 張大富.反相離子對色譜法測定溴吡斯的明的血藥濃度及生物等效性研究[J].中南藥學，2009，7（4）：285.

[6] Chen Zuanguang，Li Quanwen，Li Oulian，et al.A thin cover glass chip for contactless conductivity detection in microchip capillary electrophoresis[J].Talanta，2007，71（5）：1 944.

[7] 陳纘光，王立世，莫金垣.微全分析系統專用微型電源的研制[J].高等學?；瘜W學報，2004，25（增刊）：26.