黃麗玫,謝植基,毋福海(廣東藥學院,廣州市 510310)
小兒清肺化痰口服液是由麻黃、黃芩、葶藶子、前胡、炒紫蘇子等8味藥材經提取制成的中藥成方制劑,具有清熱化痰、止咳平喘之功效。臨床用于小兒風熱犯肺所致的咳嗽,癥見呼吸急促、咳嗽痰喘、喉中作響等。其現行標準采用高效液相色譜(HPLC)法測定鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、黃芩苷的含量[1]。已有HPLC法測定黃芩苷含量的報道[2],但槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷的含量測定還未見文獻報道。葶藶子為方中主藥,系常用中藥,具有止咳平喘、消腫利尿及強心之功效。藥理研究表明,葶藶子具有強心、止咳、平喘、抗菌、降血脂、抗癌等多方面作用[3]。葶藶子來源于十字花科植物獨行菜Lep id ium apetalumWilld.或播娘蒿Descurainia sophia(L.)Webb.ex Prantl.的干燥成熟種子,后者習稱南葶藶子。南葶藶子的化學成分研究近年受到關注[3~6],其中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷是近年來從南葶藶子中分離得到的化合物,僅存在于南葶藶子中[5],為2010年版《中國藥典》含量測定指標成分[7]。為進一步評價該制劑的質量,筆者建立了小兒清肺化痰口服液中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷含量測定的反相高效液相色譜(RP-HPLC)法,該法具有分離效果好、靈敏、準確等優點,可用于該產品的質量控制。
Agilent 1100 HPLC儀(美國安捷倫公司),包括Agilent 1100系列雙元泵、Agilent 1100可變波長檢測器、Agilent 1100/化學工作站;KQ-400KDB型高功率數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司,工作頻率100 kHz,輸出功率400 W)。
槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷對照品(中國藥品生物制品檢定所,批號:111854-201001);小兒清肺化痰口服液(北京長城制藥廠,批號:10050102、09040301、10070601,規格:每支10 mL);乙腈為色譜純,水為雙蒸水,其他試劑均為分析純。
2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷對照品10.0 mg,置于100 mL容量瓶中,加入30%甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為對照品貯備液(槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷濃度為100 μg·mL-1)。
2.1.2 供試品溶液的制備 精密量取小兒清肺化痰口服液10 mL,置于蒸發皿中,于水浴上加熱揮干,加入30%甲醇溶解,移至25 mL容量瓶中,用30%甲醇稀釋至刻度,超聲處理15 min,搖勻,濾過,棄去初濾液,續濾液用0.45 μm濾膜過濾,作為供試品溶液。
2.1.3 陰性對照溶液的制備 取處方組成中除葶藶子外的其余成分制成不含葶藶子的陰性對照,按“2.1.2”項下的制備方法處理,即得陰性對照溶液。
色譜柱:Diamonsil-C18柱(250 mm×4.6 mm,5μm);流動相:乙腈-0.1%醋酸水溶液(9∶91);流速:0.8 mL·min-1;檢測波長:260 nm;進樣量:10μL;柱溫:25℃。分別取對照品溶液(槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷濃度為30 μg·mL-1)、供試品溶液和陰性對照溶液10μL注入HPLC儀,理論板數以槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷峰計算應不低于5 500;槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷的拖尾因子為0.96,保留時間約為26.8 min,槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷峰與其他組分峰的分離度>1.5;陰性樣品不干擾測定,色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms
2.3.1 線性關系考察 分別吸取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL的槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷對照品貯備液,加30%甲醇稀釋成槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷濃度為5、10、20、30、40、50、60 μg·mL-1的溶液。依次進樣10μL,每個濃度測定3次以上。以峰面積(A)對對照品溶液系列濃度(C)進行回歸,得槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷回歸方程A=14.24C-5.12,r=0.999 9。結果表明,槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷檢測濃度在5~60μg·mL-1范圍內與峰面積積分值線性關系良好。
2.3.2 精密度試驗 取濃度為30μg·mL-1的槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷對照品溶液10μL,連續測定5次。結果,其峰面積的平均值為424.3,RSD=0.72%,表明儀器精密度良好。
2.3.3 穩定性試驗 取供試品溶液(批號:10050102)在0、2、4、6、8、10、12 h 分別進樣10 μL,記錄峰面積。結果,槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷峰面積的平均值為389.3,RSD=0.83%,表明供試品溶液在12 h內穩定。
2.3.4 重復性試驗 取同一批號(批號:10050102))樣品適量,共6份,按“2.1.2”方法提取,按“2.2”項下色譜條件測定。結果,槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷的平均含量為69.0 μg·mL-1,RSD=0.65%,表明重復性良好。
2.3.5 加樣回收率試驗 精密量取同一批號樣品(批號:10050102)適量,共6份,加入相應量的槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷對照品,照“2.1.2”方法處理,并按“2.2”項下色譜條件測定,計算加樣回收率。結果,槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷的平均加樣回收率為104.2%,RSD=0.50%,詳見表1。

表1 加樣回收率試驗結果(n=6)Tab 1Results of recovery test(n=6)
取小兒清肺化痰口服液樣品適量,共3批,照“2.1.2”方法制備供試品溶液,分別精密吸取對照品溶液(30 μg·mL-1)與供試品溶液各10 μL,注入HPLC儀,按“2.2”項下色譜條件測定,計算樣品中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷的含量,結果詳見表2。

表2 樣品含量測定結果(n≥3)Tab 2Results of sample determination(n≥3)
南葶藶子藥材有效部位中,含有以槲皮素、山柰酚、異鼠李素為苷元的多種系列黃酮類化合物,其中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷的含量最多,特征性較強,且具有較好的專屬性和平喘有效性,因此含量測定選擇以其為指標成分。
筆者在試驗過程中考察了不同提取溶劑(30%甲醇、甲醇、甲醇-鹽酸)的提取效率,發現以30%甲醇為溶劑提取較完全;對溶劑用量、提取方式(回流、超聲)、提取時間進行了優化后,確定了文中供試品的制備方法。
參照文獻方法[8]以甲醇-水為流動相,梯度洗脫,峰形較差,分離度無法滿足要求。改用乙腈-0.1%醋酸(11∶89)為流動相[7,9],出峰太快,經比較后以乙腈-0.1%醋酸(9∶91)為流動相峰形較好,分離度符合要求。
檢測波長為254 nm[7,9]測定時,小兒清肺化痰口服液樣品中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷峰附近有干擾,參照文獻[8],選定260 nm為測定波長,靈敏度高,且槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷峰附近無干擾。
綜上所述,本試驗采用RP-HPLC法測定小兒清肺化痰口服液中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷的含量,方法學驗證表明,其精密度、穩定性、加樣回收試驗和重復性均能滿足定量的要求,可用于小兒清肺化痰口服液的質量控制。
[1] 國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典(一部)[S].2010年版.北京:中國醫藥科技出版社,2010:495.
[2] 李美月,施夏蓉,唐元軍.HPLC法測定小兒清肺化痰口服液中黃芩苷的含量[J].海峽藥學,2008,20(6):61.
[3] 孫 凱,李 銑.葶藶子化學成分和藥理作用的研究進展[J].中草藥,2002,33(7):附3.
[4] 王愛芹,王秀坤,趙海譽,等.南葶藶子化學成分與質量研究[J].中國藥物與臨床,2005,5(1):5.
[5] 王愛芹,王秀坤,李軍林,等.南葶藶子的化學成分分離與結構鑒定[J].藥學學報,2004,39(1):46.
[6] 孫 凱,李 銑.南葶藶子的化學成分[J].沈陽藥科大學學報,2003,20(6):419.
[7] 國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典(一部)[S].2010年版.北京:中國醫藥科技出版社,2010:313.
[8] 王愛芹,王秀坤,閆興麗,等.HPLC測定南葶藶子中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷的含量[J].中國中藥雜志,2004,29(10):959.
[9] 李進冉,黃文華,郭寶林,等.南葶藶子藥材含量標準的研究[J].藥物分析雜志,2010,30(5):950.