RP-HPLC 法測定小兒清肺化痰口服液中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷的含量

黃麗玫，謝植基，毋福海（廣東藥學院，廣州市 510310）

小兒清肺化痰口服液是由麻黃、黃芩、葶藶子、前胡、炒紫蘇子等8味藥材經提取制成的中藥成方制劑，具有清熱化痰、止咳平喘之功效。臨床用于小兒風熱犯肺所致的咳嗽，癥見呼吸急促、咳嗽痰喘、喉中作響等。其現行標準采用高效液相色譜（HPLC）法測定鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、黃芩苷的含量[1]。已有HPLC法測定黃芩苷含量的報道[2]，但槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷的含量測定還未見文獻報道。葶藶子為方中主藥，系常用中藥，具有止咳平喘、消腫利尿及強心之功效。藥理研究表明，葶藶子具有強心、止咳、平喘、抗菌、降血脂、抗癌等多方面作用[3]。葶藶子來源于十字花科植物獨行菜Lep id ium apetalumWilld.或播娘蒿Descurainia sophia（L.）Webb.ex Prantl.的干燥成熟種子，后者習稱南葶藶子。南葶藶子的化學成分研究近年受到關注[3～6]，其中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷是近年來從南葶藶子中分離得到的化合物，僅存在于南葶藶子中[5]，為2010年版《中國藥典》含量測定指標成分[7]。為進一步評價該制劑的質量，筆者建立了小兒清肺化痰口服液中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷含量測定的反相高效液相色譜（RP-HPLC）法，該法具有分離效果好、靈敏、準確等優點，可用于該產品的質量控制。

1 儀器與試藥

Agilent 1100 HPLC儀（美國安捷倫公司），包括Agilent 1100系列雙元泵、Agilent 1100可變波長檢測器、Agilent 1100/化學工作站；KQ-400KDB型高功率數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，工作頻率100 kHz，輸出功率400 W）。

槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：111854-201001）；小兒清肺化痰口服液（北京長城制藥廠，批號：10050102、09040301、10070601，規格：每支10 mL）；乙腈為色譜純，水為雙蒸水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷對照品10.0 mg，置于100 mL容量瓶中，加入30%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液（槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷濃度為100 μg·mL－1）。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密量取小兒清肺化痰口服液10 mL，置于蒸發皿中，于水浴上加熱揮干，加入30%甲醇溶解，移至25 mL容量瓶中，用30%甲醇稀釋至刻度，超聲處理15 min，搖勻，濾過，棄去初濾液，續濾液用0.45 μm濾膜過濾，作為供試品溶液。

2.1.3 陰性對照溶液的制備 取處方組成中除葶藶子外的其余成分制成不含葶藶子的陰性對照，按“2.1.2”項下的制備方法處理，即得陰性對照溶液。

2.2 色譜條件及系統適用性試驗

色譜柱：Diamonsil-C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈-0.1%醋酸水溶液（9∶91）；流速：0.8 mL·min－1；檢測波長：260 nm；進樣量：10μL；柱溫：25℃。分別取對照品溶液（槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷濃度為30 μg·mL－1）、供試品溶液和陰性對照溶液10μL注入HPLC儀，理論板數以槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷峰計算應不低于5 500；槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷的拖尾因子為0.96，保留時間約為26.8 min，槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷峰與其他組分峰的分離度＞1.5；陰性樣品不干擾測定，色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系考察 分別吸取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL的槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷對照品貯備液，加30%甲醇稀釋成槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷濃度為5、10、20、30、40、50、60 μg·mL－1的溶液。依次進樣10μL，每個濃度測定3次以上。以峰面積（A）對對照品溶液系列濃度（C）進行回歸，得槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷回歸方程A＝14.24C－5.12，r＝0.999 9。結果表明，槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷檢測濃度在5～60μg·mL－1范圍內與峰面積積分值線性關系良好。

2.3.2 精密度試驗 取濃度為30μg·mL－1的槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷對照品溶液10μL，連續測定5次。結果，其峰面積的平均值為424.3，RSD＝0.72%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩定性試驗 取供試品溶液（批號：10050102）在0、2、4、6、8、10、12 h 分別進樣10 μL，記錄峰面積。結果，槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷峰面積的平均值為389.3，RSD＝0.83%，表明供試品溶液在12 h內穩定。

2.3.4 重復性試驗 取同一批號（批號：10050102））樣品適量，共6份，按“2.1.2”方法提取，按“2.2”項下色譜條件測定。結果，槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷的平均含量為69.0 μg·mL－1，RSD＝0.65%，表明重復性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗 精密量取同一批號樣品（批號：10050102）適量，共6份，加入相應量的槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷對照品，照“2.1.2”方法處理，并按“2.2”項下色譜條件測定，計算加樣回收率。結果，槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷的平均加樣回收率為104.2%，RSD＝0.50%，詳見表1。

表1 加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab 1Results of recovery test（n＝6）

2.4 樣品含量測定

取小兒清肺化痰口服液樣品適量，共3批，照“2.1.2”方法制備供試品溶液，分別精密吸取對照品溶液（30 μg·mL－1）與供試品溶液各10 μL，注入HPLC儀，按“2.2”項下色譜條件測定，計算樣品中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷的含量，結果詳見表2。

表2 樣品含量測定結果（n≥3）Tab 2Results of sample determination（n≥3）

3 討論

南葶藶子藥材有效部位中，含有以槲皮素、山柰酚、異鼠李素為苷元的多種系列黃酮類化合物，其中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷的含量最多，特征性較強，且具有較好的專屬性和平喘有效性，因此含量測定選擇以其為指標成分。

筆者在試驗過程中考察了不同提取溶劑（30%甲醇、甲醇、甲醇-鹽酸）的提取效率，發現以30%甲醇為溶劑提取較完全；對溶劑用量、提取方式（回流、超聲）、提取時間進行了優化后，確定了文中供試品的制備方法。

參照文獻方法[8]以甲醇-水為流動相，梯度洗脫，峰形較差，分離度無法滿足要求。改用乙腈-0.1%醋酸（11∶89）為流動相[7，9]，出峰太快，經比較后以乙腈-0.1%醋酸（9∶91）為流動相峰形較好，分離度符合要求。

檢測波長為254 nm[7，9]測定時，小兒清肺化痰口服液樣品中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷峰附近有干擾，參照文獻[8]，選定260 nm為測定波長，靈敏度高，且槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷峰附近無干擾。

綜上所述，本試驗采用RP-HPLC法測定小兒清肺化痰口服液中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷的含量，方法學驗證表明，其精密度、穩定性、加樣回收試驗和重復性均能滿足定量的要求，可用于小兒清肺化痰口服液的質量控制。

[1] 國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（一部）[S].2010年版.北京：中國醫藥科技出版社，2010：495.

[2] 李美月，施夏蓉，唐元軍.HPLC法測定小兒清肺化痰口服液中黃芩苷的含量[J].海峽藥學，2008，20（6）：61.

[3] 孫 凱，李 銑.葶藶子化學成分和藥理作用的研究進展[J].中草藥，2002，33（7）：附3.

[4] 王愛芹，王秀坤，趙海譽，等.南葶藶子化學成分與質量研究[J].中國藥物與臨床，2005，5（1）：5.

[5] 王愛芹，王秀坤，李軍林，等.南葶藶子的化學成分分離與結構鑒定[J].藥學學報，2004，39（1）：46.

[6] 孫 凱，李 銑.南葶藶子的化學成分[J].沈陽藥科大學學報，2003，20（6）：419.

[7] 國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（一部）[S].2010年版.北京：中國醫藥科技出版社，2010：313.

[8] 王愛芹，王秀坤，閆興麗，等.HPLC測定南葶藶子中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷的含量[J].中國中藥雜志，2004，29（10）：959.

[9] 李進冉，黃文華，郭寶林，等.南葶藶子藥材含量標準的研究[J].藥物分析雜志，2010，30（5）：950.