響應面法優選苦豆子多糖活性炭脫色工藝Δ

單曉菊，邸明磊，張巖，馬麗娜，陶遵威（.天津中醫藥大學，天津市30093；2.天津市醫藥科學研究所，天津市 300020）

苦豆子（Sophora alopecuroides L.）系豆科槐屬多年生草本植物[1]，主要分布在我國西北部干旱荒漠區?？喽棺尤晡犊?，性寒，藥用根、莖、全草和種子，具有清熱解毒、祛風燥濕、止痛殺蟲等作用[2]。長期以來對苦豆子的研究多圍繞其生物堿成分，對苦豆子多糖的研究較少，而近年來植物多糖的生物活性越來越受到重視。為了開發苦豆子多糖，課題組對苦豆子多糖進行了初步研究，發現其具有明顯的抗腫瘤作用?？喽棺铀岽汲梁蟮玫降亩嗵菫槌燃t色，影響產品外觀、質量標準和安全。因此，苦豆子多糖脫色工藝顯得尤為重要?；钚蕴渴且环N良好的吸附劑，具有吸附量大、再生速度快、污染小、對液體的流通阻力小等優點。有研究表明[3]，活性炭的脫色效果顯著，但對多糖的吸附能力不高。因此，課題組選用活性炭為吸附劑，應用響應面優化法，進行苦豆子多糖脫色工藝的研究，以期找到適合工業化生產的苦豆子多糖最佳脫色工藝。

1 儀器與試藥

JJ500電子天平（常熟市雙杰測試儀器廠）；UV-260紫外分光光度計（日本Shimadzu公司）；LXJ-ⅡB低速大容量多管離心機（北京醫用離心機廠）；HH-4智能數顯恒溫水浴鍋（鞏義市予華儀器有限責任公司）；真空冷凍干燥機（美國Labconco公司）。

苦豆子（豆科槐屬，購于內蒙古磴口縣金豆商貿有限公司，經天津市醫藥科學研究所天然藥化室吳壽金研究員鑒定為真品）?；钚蕴浚ㄌ旖蚴腥鸾鹛鼗瘜W品有限公司，批號：20090328）；無水乙醇、95%乙醇、濃硫酸、苯酚等試劑和葡萄糖均為分析純，購自天津市化學試劑批發公司。

2 方法

2.1 苦豆子多糖含量測定

采用苯酚-硫酸法[4]。精密稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖20mg，置500m L量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，配成0.04mg·m L-1的標準溶液。精確移取標準溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8m L，置具塞試管中，各加水補充至2.0 m L，然后加入質量分數為6%的重蒸苯酚1.0m L、濃硫酸6.0 m L，搖勻，室溫放置10m in，于490 nm波長處測定吸光度。以2.0m L水按同樣顯色操作作為空白，以吸光度（x）對葡萄糖質量濃度（y）作回歸處理，得回歸方程為y＝1.030 x－0.008（r＝0.999 5）。按下式計算多糖損失率：多糖損失率＝（脫色前多糖含量－脫色后多糖含量）/脫色前多糖含量×100%。

2.2 苦豆子多糖的提取

取苦豆子干品200 g，以85%乙醇回流脫脂3次，藥渣置于通風處晾干，加20倍量水，在100℃沸水中提取3 h，趁熱用布氏漏斗抽濾，減壓濃縮，加4倍體積95%乙醇醇沉，置冰箱過夜，3 000 r·m in-1離心20m in，沉淀用適量無水乙醇洗滌2遍，真空冷凍干燥48 h，得苦豆子粗多糖，sevage法[5]脫蛋白后得苦豆子多糖，備用。

2.3 脫色率的計算

準確稱取除蛋白后的苦豆子多糖5 g，加水溶解并定容至500m L，得苦豆子多糖溶液。在可見-紫外光譜700～200 nm波長范圍內掃描，結果溶液無最大吸收波長。根據多糖溶液脫色前后均為橙黃色，故從溶液的互補色考慮選擇測定波長為450 nm[3]，并按下式計算脫色率：脫色率＝（脫色前吸光度－脫色后吸光度）/脫色前吸光度×100%。

2.4 單因素試驗

取“2.2”項下的苦豆子多糖溶液若干份，各20m L，依次以活性炭添加量、脫色時間、脫色溫度為變量，測定苦豆子多糖損失率和脫色率，用以研究以上各變量對苦豆子多糖脫色效果的影響。

2.5 響應面優化試驗

在單因素試驗基礎上，采用中心組合試驗Box-Behnken設計方案，以活性炭添加量（W/V，A）、脫色時間（B）、脫色溫度（C）為考察因素，并以+1、0、-1分別代表變量的水平，用響應面法優化工藝。因素水平見表1。

表1 因素水平Tab 1 Factorsand levels

3 結果

3.1 單因素試驗

3.1.1 活性炭添加量對脫色效果的影響 分別選取活性炭添加量為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%、5.0%，于40℃脫色1 h，離心，取上清液，測定脫色率和多糖損失率，結果分別見圖1、圖2。

由圖1、圖2可知，苦豆子多糖脫色率隨著活性炭添加量的增加呈現先增加后降低的趨勢，添加量＞3%后脫色率明顯下降，原因可能是活性炭添加量過大不利于完全脫炭，反而影響多糖的脫色率；多糖損失率隨活性炭添加量的增加而增加，主要原因是活性炭對多糖有少量的吸附作用。綜上所述，活性炭的添加量應選擇3%以下。

3.1.2 脫色時間對脫色效果的影響 取活性炭添加量為1%，在40 ℃水浴下分別脫色20、30、40、50、60、70、80、90、100m in，離心，取上清液，測定脫色率和多糖損失率，結果分別見圖3、圖4。

由圖3、圖4可知，苦豆子多糖脫色率在60min達到最大，以后隨時間增加緩慢降低；多糖損失率隨時間增加而增加，60 m in以后增長迅速。綜合考慮，脫色時間選擇應＜60m in。

3.1.3 脫色溫度對脫色效果的影響 取活性炭添加量為1%，分別于20、30、40、50、60 ℃脫色1 h，離心，取上清液，測定脫色率和多糖損失率，結果分別見圖5、圖6。

由圖5、圖6可知，苦豆子多糖脫色率在50℃達到最大值，而多糖損失率在30℃以后無明顯變化。綜合考慮，脫色溫度選擇應＞30℃。

3.2 響應面試驗結果

3.2.1 試驗結果 以脫色率為評價指標優選工藝。試驗設計方案及結果見表2。

表2 試驗設計方案及結果Tab 2 Experimentaldesign and results

3.2.2 模型的建立及其顯著性檢驗 利用Design-Expert7.1.6軟件對表2中試驗數據進行多元回歸擬合，得到苦豆子多糖提取率對活性炭添加量（X1）、脫色時間（X2）、脫色溫度（X3）的二次多項回歸模型：脫色率＝13.775 00+20.250 00X1+1.412 50X2+0.050 000X3－0.215 00X1X2+0.115 00X1X3－7.250 00E－003X2X3－6.850 00X12－7.125 00E－003X22+2.375 00E－003X32。對該回歸模型及其系數進行顯著性檢驗，結果見表3。

表3 回歸模型及方差分析結果Tab 3 Decolorization regression model and analysis of variance

由表3可知，回歸模型的P＝0.0002＜0.01，添加量和脫色時間對脫色率影響極為顯著，脫色溫度對脫色率影響較顯著。本試驗得到的二次多項式模型具有高度的顯著性，失擬項在P＝0.05水平上不顯著（P＝0.492 4＞0.05），表明此模型的擬合度很好，能夠準確預測和分析苦豆子多糖活性炭脫色工藝結果。

3.2.3 脫色工藝的響應曲面分析與優化 根據表3中結果繪制各因素間的三維效應圖，詳見圖7。

由圖7可看出，活性炭添加量、脫色時間和脫色溫度之間的相互作用對苦豆子多糖脫色率影響不顯著，活性炭添加量和脫色時間對苦豆子多糖脫色率的影響很大，隨著活性炭添加量和脫色時間的增加，苦豆子多糖脫色率也隨著相應的增加。經優化后得到的浸提工藝條件為活性炭添加量0.99%，脫色時間59.6m in，脫色溫度40.3℃，其脫色率可達到66.4%。

3.3 工藝驗證試驗

在最佳脫色條件下進行3次驗證試驗，得到的多糖脫色率分別為66.9%、66.7%、66.2%，平均值為66.6%，與預測值的相對誤差為0.30%；多糖損失率分別為6.42%、5.96%、6.12%，平均值為6.17%。證明響應面法優化苦豆子多糖脫色工藝是可行的。

4 討論

在響應面優化的苦豆子多糖活性炭脫色工藝下可得到最佳的脫色效果，且多糖損失率低。活性炭為黑色細微粉末，無臭、無味，具有無毒、脫色效果好的特點，可以反復使用，成本低，適合工業化生產。

[1]史 偉，陳志國.苦豆子的開發與利用[J].草業與畜牧，2007，1：57.

[2]劉勇民.維吾爾藥志（上）[M].烏魯木齊：新疆科技衛生出版社，1999：259-299.

[3]和殿峰，李跟區，陳愛娜.正交試驗優選魚腥草多糖活性炭脫色工藝[J].中國藥房，2009，20（6）：434.

[4]劉 敏，郭麗梅，張 麗.苯酚-硫酸法測定油松花粉多糖含量研究[J].時珍國醫國藥，2010，21（6）：1 526.

[5]張善玉.天然產物多糖脫蛋白方法的研究[J].中國藥房，2009，20（33）：2 633.