蘭州肉蓯蓉HPLC指紋圖譜研究

朱旭江，賀軍權，杜興，劉霞（1.中國科學院蘭州化學物理研究所，蘭州市730000；.甘肅省食品藥品檢驗所，蘭州市 730000；3.中國科學院研究生院，北京市 100039）

蘭州肉蓯蓉，種名為Cistanche Lanzhouensis Z.Y.Zhang.，生于荒漠草原、半荒漠的山前平原及沙質梁地和黃土丘陵、河谷溝等地。蘭州肉蓯蓉寄主單一，目前僅發現其寄生于植物紅沙Reaumuria soongorica（Pall.）Maxim的根上，常在海拔1 500～2 000m，多在1 600m左右紅沙分布廣的地區分布。2010年版《中國藥典》（一部）將列當科植物肉蓯蓉（C.deserticola Y.C.Ma）和管花肉蓯蓉（C.tubulosa（Schrenk）Wight）共同作為肉蓯蓉的基原植物[1]。肉蓯蓉味甘、咸、微辛酸，性微溫，在《神農百草經》中列為上品[2]，具有極高的藥用價值，有“沙漠人參”之美譽，是我國傳統的名貴中藥材，具有滋肝養腎、益精血、潤腸通便之功效[3～9]。肉蓯蓉主要含苯乙醇苷類、環烯醚萜及其苷類、木脂素苷類、多元醇、多糖等成分[10]，其中苯乙醇苷類物質為肉蓯蓉補腎益精的主要有效成分[11，12]，具抗氧化、神經保護、改善學習記憶、免疫調節等作用[13]。由于多年的破壞性采挖，野生肉蓯蓉資源已瀕臨枯竭，肉蓯蓉已被列入二級瀕危保護植物，并收入《國際野生植物保護名錄》[14～16]。在某些地方，蘭州肉蓯蓉也被當作肉蓯蓉入藥[17]，且蘭州肉蓯蓉的多糖含量和正品肉蓯蓉相當[18]。目前蘭州肉蓯蓉的特征圖譜研究尚未見報道，因此本試驗采用反相高效液相色譜（RP-HPLC）法建立蘭州肉蓯蓉甲醇提取物的特征圖譜，為建立其穩定、可靠、全面的質量評價和品種鑒別方法提供科學依據。

1 儀器與試藥

HPLC儀，含1525型輸液泵、2487型紫外檢測器、2996型檢測器、717型自動進樣器、Empower色譜軟件（美國Waters公司）；KQ5200型超聲波提取器（昆山市超聲儀器有限公司，頻率：40 kHz，功率：200W）。

肉蓯蓉對照藥材、毛蕊花糖苷對照品、松果菊苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號分別為1101-212300001、1530-200202、11167-200503）；肉蓯蓉 C.deserticola（來源：新疆）、肉蓯蓉C.deserticola（來源：青海）、鹽生肉蓯蓉C.salsa（來源：甘肅酒泉）、蘭州肉蓯蓉C.Lanzhouensis（來源：蘭州市區及各郊縣，共10批）均由原蘭州市藥品檢驗所專家鑒定為真品，標本現存于甘肅省食品藥品檢驗所；乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：ZORBAX SB C18（250mm×4.6mm，5μm）；檢測波長：330 nm；流速：1.0m L·m in-1；柱溫：30 ℃；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（洗脫程序見表1）。理論板數以毛蕊花糖苷峰計算應不低于2 000。

2.2 溶液的配制

2.2.1 對照品溶液 精密稱取毛蕊花糖苷對照品20.12mg，置100m L棕色容量瓶中，作為毛蕊花糖苷對照品貯備液；精密稱取松果菊苷對照品14.00mg，置50m L棕色容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，作為松果菊苷對照品貯備液。取上述貯備液各5 m L，分別置10m L棕色容量瓶中，分別制成每1m L含毛蕊花糖苷對照品0.1mg和每1m L含松果菊苷對照品0.14mg的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 樣品粉碎后過四號篩，精密稱取粉末1 g，用甲醇超聲提取3次（30、20、20m L），每次15m in，濾過，合并濾液，濃縮至干，用10%乙腈定容至10m L，搖勻，0.45μm濾膜濾過，取續濾液，即得。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 G radientelution

2.3 方法學考察

2.3.1 參照物試驗 精密吸取毛蕊花糖苷對照品溶液10μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，其主峰的保留時間用于確定肉蓯蓉藥材中毛蕊花糖苷的峰位。

2.3.2 進樣精密度試驗 取同一份蘭州肉蓯蓉（蘭州市）供試品溶液適量，連續進樣6次，每次10μL，記錄色譜圖。結果，各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD分別＜2%和3%，表明方法精密度良好。

2.3.3 重復性試驗 精密稱取蘭州肉蓯蓉藥材（蘭州市）粉末適量，按“2.2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，分別進樣10μL進行分析。結果，各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均＜3%，表明方法重復性良好。

2.3.4 穩定性試驗 取同一份蘭州肉蓯蓉（蘭州市）供試品溶液，分別于0、3、6、12、24、48 h時進樣10 μL進行分析。結果，各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均＜3%，表明供試品溶液在室溫放置48 h內穩定。

3 結果

3.1 樣品的測定

取10批不同產地的蘭州肉蓯蓉藥材粉末各適量，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別精密吸取供試品溶液10μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件進行測定，并記錄110min內的色譜圖。將10批蘭州肉蓯蓉的HPLC特征圖譜，采用國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004A版）”軟件計算相似度。指紋圖譜見圖1。

圖1 10批蘭州肉蓯蓉的HPLC指紋圖譜Fig 1 HPLC fingerprints for 10 batchesof C.Lanzhouensis

3.2 特征圖譜共有峰的確定

根據10批蘭州肉蓯蓉檢測結果，按照特征圖譜的技術要求[19]標出蘭州肉蓯蓉色譜圖中13個共有峰。各共有峰的保留時間為：峰 1（23.013 m in），峰 2（27.883 m in），峰 3（33.601 m in），峰 4（56.114 m in），峰 5（58.716 m in），峰 6（69.460 min），峰 7（70.081 min），峰 8（84.001 min），峰 9（S，87.918 min），峰 10（92.317min），峰 11（97.262min），峰 12（103.732 min），峰13（105.265min）。蘭州肉蓯蓉HPLC特征圖譜見圖2。

圖2 蘭州肉蓯蓉HPLC特征圖譜Fig 2 HPLC specific chromatogram of C.Lanzhouensis

圖2 中，9號峰為參照物毛蕊花糖苷的色譜峰，9號和10號峰單峰面積占總峰面積的百分比均超過10%，其他峰均未超過5%。故以參照物峰即9號峰的峰面積和相對保留時間為1計算，10號峰的相對保留時間為（1.047±0.003），共有指紋峰的相對峰面積為（7.523±0.066），其余峰僅標定相對保留時間，詳見表2。

3.3 相似度分析

指紋圖譜反映的是樣品整體的特征，進行指紋圖譜比較可以反映樣品之間的親疏程度，而相似度可以定量地描述指紋圖譜的相似程度。不同產地的蘭州肉蓯蓉指紋圖譜采用“中藥指紋圖譜相似度評價系統（2004A版）”軟件進行分析，該軟件可將多個色譜圖進行匯總比較，經計算得到可全面反映多個色譜圖特征的對照模式色譜圖，并以此模式為基準，計算每個色譜圖與之比較的相似度。本試驗采用相關系數評價蘭州肉蓯蓉的相似度，結果見表3。結果表明，各樣本之間有很高的相似度，說明采用本法作為蘭州肉蓯蓉藥材鑒定和質量評價的依據是切實可行的。

表2 蘭州肉蓯蓉HPLC指紋圖譜共有峰的相對保留時間Tab 2 Relative retention time of common peaksof HPLC fingerprintsof C.Lanzhouensis

表3 蘭州肉蓯蓉相似度評價結果Tab 3 Sim ilaritiesof C.Lanzhouensis

3.4 蘭州肉蓯蓉與肉蓯蓉的特征圖譜比較

取肉蓯蓉對照藥材、不同產地的蘭州肉蓯蓉和肉蓯蓉藥材，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液。分別精密吸取上述供試品溶液和毛蕊花糖苷、松果菊苷對照品溶液各10μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件進樣測定，并記錄110m in內的色譜圖，詳見圖3。

從圖3可知，蘭州肉蓯蓉在肉蓯蓉對照藥材19.65、20.69、28.88、30.108、62.418、64.03、67.24、75.44、79.44、80.33、81.86 min 色譜峰處未見色譜峰，僅在 23.67、27.24、34.08、88.81、97.11m in與對照藥材有共有峰。松果菊苷色譜峰保留時間為67.15min，毛蕊花糖苷色譜峰保留時間為88.62min。

3.5 蘭州肉蓯蓉與肉蓯蓉的相似度評價

以肉蓯蓉對照藥材色譜為對照圖譜，采用國家藥典委員會“中藥指紋圖譜相似度評價系統（2004B版）”軟件進行分析。B版須選用對照圖譜，故采用肉蓯蓉對照藥材的色譜為對照圖譜，其他樣品與對照圖譜進行相似度分析，結果見表4。

4 討論

蘭州肉蓯蓉與肉蓯蓉特征圖譜差異較大。其一，色譜峰峰數有明顯差異：與肉蓯蓉相比，蘭州肉蓯蓉出現許多特征峰的缺失，說明化合物的種類有明顯差異；其二，與肉蓯蓉對照藥材的相似度僅為0.04左右，說明蘭州肉蓯蓉與正品肉蓯蓉存在較大的差異。

松果菊苷和毛蕊花糖苷為肉蓯蓉的主要活性成分，2種成分的色譜峰保留時間分別為67m in和88m in。從結果分析，肉蓯蓉對照藥材、肉蓯蓉（青海）和肉蓯蓉（新疆）中松果菊苷峰峰形好、峰較高，含量也比較高，但蘭州肉蓯蓉在松果菊苷色譜峰處無色譜峰，說明蘭州肉蓯蓉中未檢測出松果菊苷[20]。蘭州肉蓯蓉中毛蕊花糖苷的色譜峰較高，通過含量計算，蘭州肉蓯蓉（皋蘭縣）中毛蕊花糖苷含量高于肉蓯蓉（青海）和肉蓯蓉（新疆）的含量。

圖3 HPLC特征圖譜A.毛蕊花糖苷對照品；B.松果菊苷對照品；C.肉蓯蓉對照藥材；D.蘭州肉蓯蓉（永登縣）；E.肉蓯蓉（新疆）；F.肉蓯蓉（青海）；G.肉蓯蓉（酒泉市）；H.蘭州肉蓯蓉（蘭州市）Fig 3 HPLC specific chromatogram s A.echinacoside control； B.acteoside control； C.Cistanches Herba reference substance；D.C.Lanzhouensis（Yongdeng）；E.C.deserticola（Xinjiang）；F.C.deserticola（Qinghai）；G.C.salsa（Jiuquan）；H.C.Lanzhouensis（Lanzhou）

表4 肉蓯蓉和蘭州肉蓯蓉相似度評價結果Tab 4 Sim ilarity evaluation of C.deserticola and C.Lanzhouensis

文獻報道采用乙腈-醋酸系統[21]作為流動相檢測肉蓯蓉藥材，但由于蘭州肉蓯蓉成分復雜，在文獻方法采用的梯度條件下，存在色譜峰重疊的情況。另外，醋酸體積分數較高，長期使用會影響色譜柱的使用壽命。因此，筆者比較了甲醇-水、乙腈-水系統，最后確定了乙腈-0.1%磷酸水溶液系統作為流動相。經試驗采用梯度進行洗脫，得到的信息量較豐富，各成分峰形尖銳且分離度良好。采用DAD檢測器進行全波長掃描，在210～380 nm區間選取不同波長，比較蘭州肉蓯蓉在230、280、330、334 nm波長下的HPLC圖譜，結果在330 nm波長處色譜峰信息最多，且各峰分離良好，故選擇330 nm為檢測波長。試驗中利用DAD檢測器對HPLC圖譜中主要色譜峰進行純度檢查，結果顯示各主要色譜峰純度較好，故本方法除了可以用于定性考察藥材質量外，也可用于多種單一成分同時進行定量檢測，使測定更加簡便、快捷。

綜上，該方法精密度、穩定性、重復性較好，可以作為肉蓯蓉質量評價和品種鑒別的重要依據之一。

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