固本祛風(fēng)顆粒中馬兜鈴酸Ⅰ的限量檢查

俞 冰，劉志承，李曙光（深圳市中醫(yī)院，深圳市 518033）

固本祛風(fēng)顆粒是深圳市中醫(yī)院協(xié)定處方，由黃芪、辛夷、細(xì)辛、桂枝等12味中藥組成，臨床用于治療變態(tài)反應(yīng)性鼻炎（又稱過敏性鼻炎，屬中醫(yī)“鼻鼽”范疇），療效確切。方中細(xì)辛為馬兜鈴科植物，可能含有馬兜鈴酸類成分，而馬兜鈴酸類成分具有細(xì)胞毒性且致突變性較強(qiáng)，能誘導(dǎo)DNA損傷，并能造成腎損傷[1～3]。為保證本品臨床用藥的安全性，筆者采用高效液相色譜（HPLC）法對固本祛風(fēng)顆粒中馬兜鈴酸Ⅰ進(jìn)行限量檢查。

1 儀器與試藥

20AT型HPLC儀，含LC-20AT型泵、AIL-20A型自動進(jìn)樣器、SPD-M 20A型二極管陣列檢測器、CTO-10ASvp型柱溫箱、CBM-20A型控制器、LC solution工作站（日本島津公司）；AQUELIX 5型純水機(jī)（美國密理博公司）；BP 211D型十萬分之一電子天平（德國Sartorius公司）；CQ-250-DST型超聲波清洗儀（頻率：40 kHz，功率：250W，上海躍進(jìn)醫(yī)用光學(xué)器械廠）。

甲醇、乙腈（色譜純，美國Tidea公司）；磷酸、甲醇等試劑均為分析純，水為高純水；馬兜鈴酸Ⅰ對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110746-200507，供含量測定用）；固本祛風(fēng)顆粒（深圳市中醫(yī)院自制，批號：100901、100902、100903）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：GL Inertsil ODS-SP（150mm×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈-0.05%磷酸（40∶60）；流速：1m L·min-1；柱溫：28℃；檢測波長：320 nm；進(jìn)樣量：10μL。理論板數(shù)以馬兜鈴酸Ⅰ峰計(jì)算應(yīng)不小于5 000。在此色譜條件下，樣品中其他成分對馬兜鈴酸Ⅰ峰無干擾。色譜見圖1。

2.2 對照品溶液的制備

取馬兜鈴酸Ⅰ對照品適量，精密稱定，加甲醇配制成濃度為97.20μg·m L-1的對照品貯備液。使用時加甲醇稀釋成所需濃度的對照品溶液。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

取濃度為9.72 μg·m L-1的對照品溶液，分別進(jìn)樣2、4、6、10、15、20 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測定馬兜鈴酸Ⅰ的峰面積。以峰面積積分值（Y）對對照品進(jìn)樣量（X）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y＝2 316.9X－1 050.5（r＝0.999 7，n＝6）。結(jié)果表明，馬兜鈴酸Ⅰ進(jìn)樣量在19.44～194.40 ng范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

2.4 精密度試驗(yàn)

取濃度為9.72μg·m L-1的對照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10μL，測定峰面積。結(jié)果，峰面積平均值為218 901，RSD＝0.34%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取濃度為9.72 μg·m L-1的對照品溶液，分別于第0、2、4、8、16、24 h進(jìn)樣10μL，測定馬兜鈴酸Ⅰ的峰面積。結(jié)果，峰面積平均值為217 723，RSD＝0.43%（n＝6），表明馬兜鈴酸Ⅰ在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

圖1 高效液相色譜圖A.對照品；B.供試品；C.供試品+對照品；D.陰性對照（缺細(xì)辛）；E.馬兜鈴酸Ⅰ檢測限；1.馬兜鈴酸ⅠFig 1 HPLC chromatogram s A.substance control；B.test sample；C.substance control and test sample；D.negative sample（w ithout Asarum sieboldi）；E.detection limitof aristolochic acidⅠ；1.aristolochic acidⅠ

2.6 馬兜鈴酸Ⅰ檢測限考察

取對照品溶液稀釋、進(jìn)樣，至信噪比等于3，測得馬兜鈴酸Ⅰ的最低檢測限為1.944 ng。

2.7 制劑中馬兜鈴酸Ⅰ檢查

2.7.1 供試品溶液的制備 取本品，研細(xì)，取15 g（相當(dāng)于細(xì)辛藥材1.25 g），精密稱定，置錐形瓶中，加甲醇50m L，精密稱重，超聲提取30min，放冷至室溫，加甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，0.45μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.7.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批固本祛風(fēng)顆粒，平行取樣6份，按“2.7.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測，結(jié)果均未檢出馬兜鈴酸Ⅰ。

2.7.3 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取本品15 g，平行6份，分別精密加入濃度為97.20μg·m L-1的對照品溶液5m L（相當(dāng)于馬兜鈴酸Ⅰ0.486mg），按“2.7.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定馬兜鈴酸Ⅰ峰面積，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

2.7.4 3批固本祛風(fēng)顆粒中馬兜鈴酸Ⅰ檢查 按上述方法檢查3批制劑中的馬兜鈴酸Ⅰ，結(jié)果見表2。

結(jié)果表明，在本研究條件下，3批制劑中均未檢出馬兜鈴酸Ⅰ。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 1 Resultsof recovery tests（n＝6）

表2 制劑中馬兜鈴酸Ⅰ的檢查結(jié)果（n＝3）Tab 2 Determ ination results of aristolochic acidⅠof samp les（n＝3）

3 討論

馬兜鈴酸是一種菲類化合物，主要由馬兜鈴酸Ⅰ等化合物及其衍生物組成。馬兜鈴酸Ⅰ在甲醇、乙醇等有機(jī)溶劑中有較好的溶解性，故筆者采用甲醇超聲提取樣品，提取方法簡便、可行。

筆者采用HPLC法測定固本祛風(fēng)顆粒中馬兜鈴酸Ⅰ的含量，參照文獻(xiàn)試用乙腈-0.4%冰醋酸（35∶65）[4]、甲醇-3.3%醋酸（75∶25）[5]、甲醇-水-冰醋酸（72∶27∶1）[6]、乙腈-0.05%磷酸（40∶60）作為流動相進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果乙腈-0.05%磷酸（40∶60）分離效果較好，故采用該流動相。

本試驗(yàn)測定結(jié)果表明，3批樣品均未檢出馬兜鈴酸Ⅰ。本方法操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，可以作為固本祛風(fēng)顆粒中馬兜鈴酸Ⅰ的限量檢測方法。

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