農桿菌介導P2300-pa-8e抗蟲基因轉化馬鈴薯的研究

楊志超 張麗莉 盧翠華* 邸 宏 姜麗麗 張正國 林忠平胡鳶雷

（1東北農業大學農學院，黑龍江哈爾濱 150030；2北京大學生命科學學院，北京 100871）

馬鈴薯（Solanum tuberosumL.）是茄科茄屬雙子葉植物，是世界四大糧食作物之一，由于它具有適應性強、產量高、營養成分全和加工產業鏈長等特點，受到了全世界的廣泛重視。我國是世界馬鈴薯生產第一大國，面積和總產量占全世界的1/4（盧翠華 等，2009）。

蟲害是造成馬鈴薯減產的主要原因，其中金龜子科害蟲金龜子（幼蟲俗稱蠐螬）是世界范圍內廣泛分布的地下害蟲之一。金龜子成蟲、幼蟲均可危害馬鈴薯，但幼蟲危害較大。傳統化學藥劑防治不僅危害人類健康，而且造成環境污染（姚慶學 等，2003）。自1996年轉基因作物商業化以來，全球種植的抗蟲轉基因作物面積已經達到2 625萬hm2（James，2008）。其中對金龜子科害蟲具有殺蟲作用的蘇云金芽胞桿菌cry類基因的相繼發現和克隆，為害蟲的防治提供了新的途徑。Yu等（2006）從Bt185中克隆了P2300-pa-8ea1基因。

本試驗將來源于Bt菌株Bt185的P2300-pa-8e基因導入馬鈴薯中，期望獲得抗蟲的馬鈴薯材料，為馬鈴薯抗性育種提供新資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和菌株

試驗于2009年7月～2010年5月在東北農業大學馬鈴薯實驗室進行。

供試馬鈴薯品種為早大白和克新18號（東北農業大學提供）。

供試農桿菌菌種為LBA4404（北京大學生命科學學院提供），植物表達載體質粒P2300-Pa-8e（圖1），利用Patatin啟動子驅動P2300-pa-8e（500 bp）基因的表達，質粒由北京大學生命科學學院林中平教授提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 工程菌液的制備 挑取含有質粒P2300-Pa-8e的農桿菌LBA4404單菌落接種于含有卡那霉素（Kan）、鏈霉素（Str）和利福平（Rif）的YEB培養基中，避光震蕩培養。從中取500 μL菌液接種于50 mL相同的YEB培養基中，以相同條件震蕩培養。到對數生長期，在4 000 r·min-1條件下離心5 min，棄上清液，重懸于MS液體培養基中，為工程菌液。

1.2.2 薯塊再生培養基的篩選 將馬鈴薯早大白和克新18號脫毒微型薯滅菌、去皮，切成薄片，放入工程菌液中進行定時侵染，轉入共培養培養基，28 ℃黑暗條件下培養 2～3 d。分別接種于9種再生培養基上（表1），誘導薯塊出芽。待芽長到2～3 cm時剪下，轉入生根培養基生根（叢培琳 等，2008；姜麗麗 等，2009）。

1.2.3 共培養時間對遺傳轉化的影響 在菌液OD600值為0.5、浸染時間為5 min的條件下，用農桿菌感染薯片，置于 28 ℃黑暗條件下分別培養1、2、3、4、5 d，在誘導培養基上培養20 d，統計抗性愈傷的誘導率。

1.2.4 PCR檢測 使用索來寶公司的植物總DNA提取試劑盒提取馬鈴薯植株的總DNA，以轉化植株的總DNA為模板，未轉化植株的總DNA作陰性對照，以P2300-pa-8e質粒為陽性對照，根據P2300-pa-8e基因序列，設計特異性引物（PrimerⅠ：5′-GGCGGCAGCATTCAAACTCAA-3′，PrimerⅡ：5′-ATCTCCACCAAGATAGTGTCC-3′），對目標基因進行擴增。PCR體系（25 μL）：超純水16.5 μL，25 mg·mL-1MgCl21.5μL，10×Buffer 2.5 μL，10 mmol·L-1dNTP 2.0 μL，10 μmol·L-1PrimerⅠ 0.5 μL，10 μmol·L-1primerⅡ 0.5μL，50 ng·μL-1模板1.0 μL，5 U·μLTaq酶0.5 μL。PCR反應程序：94 ℃預變性8 min；94 ℃變性30 s，52.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環；72 ℃延伸8 min；4 ℃終止反應。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

圖1 P2300-Pa-8e植物表達質粒結構示意圖

表1 不同薯塊再生培養基的激素配比

1.2.5 Southern-blot雜交檢測 用SacⅠ酶切轉基因植株DNA，將酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳，經變性、中和，用高鹽轉移法（薩姆布魯克，2002）將膠上的樣品轉移到尼龍膜上，以目的基因P2300-pa-8e為探針，采用地高辛試劑盒進行雜交、洗膜、顯影。

1.2.6 轉基因植株的移栽 將通過Southern-blot雜交檢測的轉基因植株培養15～20 d，煉苗后移入小盆中，放入溫室培養，7 d左右轉入網室培養。

1.2.7 抗蟲試驗 用轉基因小薯與對照小薯分別喂養暗黑鰓金龜幼蟲（3～4日齡）、華北大黑鰓金龜幼蟲（3～4日齡）、黃粉蟲幼蟲和超級大麥蟲幼蟲。暗黑鰓金龜（3～4日齡）、華北大黑鰓金龜（3～4日齡）的幼蟲采用室內殺蟲活性測定（王容燕 等，2007），黃粉蟲、超級大麥蟲的幼蟲采用飼料混合法（張杰 等，2002）進行生物測定。每處理 24頭初孵幼蟲，3次重復，置于光照培養箱中培養，分別于48、72、96 h記錄死蟲數，并計算校正死亡率。

2 結果與分析

2.1 共培養時間的確定

共培養時間的長短對遺傳轉化效率有影響，而且不同物種及外植體材料與農桿菌的最佳共培養時間也不同。從圖2可以看出，早大白和克新18號薯片的共培養時間均在第3天時抗性愈傷組織誘導率最高，分別為92.16%和97.77%。

圖2 共培養時間對遺傳轉化的影響

2.2 薯塊再生培養基的確定

以MS為基本培養基，以早大白為試材，研究添加IAA和ZT兩種激素對誘導馬鈴薯再生率的影響。試驗結果表明（表2），使用M8培養基時，獲得的出芽率最高，高達 93.55%；而使用M1培養基培養的薯塊出芽率最低，僅有33.33%。因此，本試驗條件下最優薯塊再生培養基為M8（MS+4.0 mg·L-1ZT +1.0 mg·L-1IAA）。

表2 不同激素濃度配比對早大白薯塊生長的影響

2.3 轉基因植株與薯塊的獲得

馬鈴薯薯塊經培養20～30 d后分化出芽。早大白接種薯塊 36塊，誘導產生再生植株 42株，有19株通過生根階段篩選，抗性植株再生頻率為52.78%；克新18號接種薯塊32塊，誘導產生再生植株54株，有21株通過生根階段篩選，抗性植株再生頻率為65.63%。將抗性植株移入網室，9月收獲薯塊（圖3）。

圖3 農桿菌介導克新18號薯塊遺傳轉化再生植株與小薯的獲得

2.4 PCR檢測

對早大白和克新 18號所獲得的抗性植株進行PCR鑒定，得到了約500 bp的特異性條帶（圖4），與陽性對照質粒的擴增結果一致，陰性對照沒有特異性擴增條帶。PCR檢測結果初步表明，P2300-pa-8e基因已整合到受體基因組中。

圖4 抗性植株PCR檢測

2.5 Southern-blot雜交檢測

將PCR檢測呈陽性的植株進行Southern-blot雜交，使用SacⅠ對轉基因植株DNA進行酶切，在5株早大白、10株克新18號PCR陽性植株中，4株早大白、6株克新18號有雜交信號（圖5），其中4株為雙拷貝，6株為單拷貝。不同植株外源基因插入位點不同，說明不同植株之間是相對獨立的轉基因植株。

圖5 轉化植株Southern-blot雜交檢測

2.6 抗蟲試驗

以非轉基因馬鈴薯為對照，測定P2300-pa-8e基因表達產物對暗黑鰓金龜、華北大黑鰓金龜、黃粉蟲、超級大麥蟲幼蟲的毒力。結果表明，對暗黑鰓金龜、華北大黑鰓金龜齡幼蟲7 d的校正死亡率分別為26.38%、34.72%；14 d的校正死亡率分別為47.22%、55.56%；而對黃粉蟲、超級大麥蟲幼蟲均未表現活性。

3 結論與討論

選擇馬鈴薯微型薯作為外植體，遺傳轉化過程中具有再生速度快、出芽率高、易于操作等優點。

培養基中激素的組成和濃度是影響植株再生的關鍵，生長素和分裂素比例合適可以提高胚狀體發生頻率。從諸多馬鈴薯再生培養的報道中可以看出，所使用的外源激素大相徑庭（張寧等，2004），用一種或幾種培養基并不適合所有的品種。因此，需針對不同基因型選擇誘導再生的激素種類和濃度。本試驗使用MS+4.0 mg·L-1ZT+1.0 mg·L-1IAA為薯塊再生培養基時獲得的出芽率最高，高達93.55%。

適當的共培養時間能提高轉化效率，本試驗結果表明，共培養時間以外植體周圍剛出現白色菌落時為最佳（一般共培養2～3 d），早大白和克新18號最佳共培養時間均為3 d。這樣既可提高轉化頻率，又易于去除農桿菌。達到最佳生長狀態的共培養時間則由農桿菌菌液的生長狀態、菌液濃度、外植體類型及培養條件等決定。

對誘導生根的40株馬鈴薯抗性植株進行PCR檢測，有14株呈PCR陽性反應，但都出現了非特異性擴增條帶，其原因可能是：① 引物與靶序列不完全互補或引物聚合形成二聚體。② Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環次數過多。③ 酶的質和量，有些來源的酶易出現非特異條帶，而另一來源的酶則不出現；酶量過多有時也會出現非特異性擴增。

經Southern-blot檢測，有10株為轉基因植株，表明在本試驗中存在假轉化體。分析原因可能有：① 外植體的表層細胞穩定表達外源選擇抗性基因，為其他一些非轉化細胞提供了一道屏障，逃避了選擇壓力的影響而繼續分裂和分化。② T-DNA進入細胞后并沒有整合到受體基因組中，而是以游離狀態存在，導致PCR呈陽性反應。因此只有進行植物基因組的Southern-blot分析，才可以準確地了解外源基因在轉化植株基因組中的整合情況。

本試驗通過對薯塊的抗蟲試驗，結果表明轉基因馬鈴薯對鱗翅目害蟲黃粉蟲、超級大麥蟲無活性，對鞘翅目害蟲暗黑鰓金龜和華北大黑鰓金龜表現出抗性，為馬鈴薯抗性品種的培育提供了新的材料和方法。

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