三氯甲烷和乙醇對轉基因成分檢測的抑制

王 東 ， 宋 君 ， 尹 全 ， 陶 李 ， 雷紹榮 ，劉 勇

（1.四川省農業科學院分析測試中心，四川 成都 610066；2.農業部轉基因植物環境安全監督檢驗測試中心（成都），四川 成都 610066）

0 引 言

隨著近年生物技術的迅猛發展，大豆、玉米、棉花、油菜等100多個轉基因作物品種已經商業化種植[1]。據不完全統計，由轉基因作物加工生產的轉基因食品約達4000種[2（]其中豆制品最多），包括部分食用油、醬油、番茄醬、薯條（片）、玉米片、漢堡包等。轉基因產品的食用安全問題，雖然一直受到世界各國政府和公眾的極大關注[3]，但目前沒有科學證據表明食用轉基因產品對身體有害。目前很多國家對轉基因產品實施標識管理，因此，轉基因產品的檢測鑒定已成為各主要貿易國的一項重要工作[4]。

在轉基因成分檢測的DNA分離純化過程中，三氯甲烷和乙醇往往不能完全除盡而成為后期PCR反應的抑制劑。迄今，關于三氯甲烷和乙醇這2種有機試劑在轉基因食品安全檢測中的抑制作用未見報道。該文以抗除草劑（CP4-EPSPS）轉基因大豆（GTS40-3-2）為研究材料，模擬三氯甲烷和乙醇在反應體系中的殘留，探討這2種有機試劑的殘留量對Lectin基因擴增的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

抗除草劑（CP4-EPSPS）轉基因大豆GTS-40-3-2，購自歐盟標準物質和計量研究所（institute for reference materials and measurements，IRRM）。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA的分離純化

采用GB/T 19495.3-2004《轉基因產品檢測核酸提取純化方法》附錄C中CTAB法提取DNA[5]。

1.2.2 Lectin基因擴增

采用GB/T 19495.4-2004《轉基因產品檢測核酸定性PCR檢測方法》的引物和反應條件[6]。擴增轉基因大豆內標基因Lectin引物序列，former：5′-GCCCTCTACTCCACCCCCATCC-3′，reverse：5′-GCCCATCTGCAAGCCTTTTTGTG-3′。擴增條件：預變性為95℃ 10 min，1個循環；PCR反應為95℃20s，60℃ 40s，72℃ 40s，共 40 個循環；延伸為 72℃3min。

1.2.3 三氯甲烷殘留的PCR反應體系

25 μL反應體系，各成分終濃度為2×Taq PCR Master Mix（Tiangen 公司）12.5 μL，上、下游引物0.4 μmol/L，DNA 模板 2 ng/μL，三氯甲烷摩爾濃度梯度見表1，最后補充滅菌超純水至總體積25 μL。

表1 三氯甲烷摩爾濃度梯度表

1.2.4 乙醇殘留的PCR反應體系

25 μL反應體系，各成分終濃度為2×Taq PCR Master Mix（Tiangen 公司）12.5 μL，上、下游引物0.4μmol/L，DNA 模板 2ng/μL，乙醇濃度梯度見表2，最后補充滅菌超純水至總體積25 μL。

表2 乙醇摩爾濃度梯度表

2 結果與分析

2.1 三氯甲烷對PCR反應抑制

轉基因大豆GTS-40-3-2內標基因Lectin的擴增實驗結果顯示，未加三氯甲烷時，內標基因Lectin正常擴增，設置的空白對照正常，說明反應體系能正常工作，實驗條件無污染。在25 μL反應體系中，逐次增加三氯甲烷的含量，其PCR反應受到的抑制作用也相應增強，直至PCR反應完全受到抑制。電泳結果顯示如圖1所示，在25 μL反應體系中，三氯甲烷的含量在 1～5 μL（0.50～2.51 mol/L）時，條帶信號（亮度）逐漸減弱，但信號衰減不明顯，表明PCR對三氯甲烷的耐受性較強，三氯甲烷對PCR有一定的抑制作用，但并不明顯；當加入6～7μL（3.02～3.52 mol/L）三氯甲烷時，條帶信號（亮度）衰減明顯，說明PCR擴增反應在3.02～3.52 mol/L濃度范圍內受到三氯甲烷明顯的抑制作用；在反應體系中，當三氯甲烷含量達到 7.5 μL（3.77 mol/L）時，PCR擴增反應被徹底抑制。

圖1 三氯甲烷對PCR反應的抑制作用

2.2 乙醇對PCR反應抑制

當未加乙醇時，設置的對照正常，說明轉基因大豆GTS-40-3-2內標基因Lectin的擴增體系和實驗條件符合實驗要求。添加乙醇的實驗結果表明，乙醇對轉基因檢測的PCR反應有較強的抑制作用，其抑制程度隨乙醇濃度的增加而加大。在25μL反應體系中，當乙醇殘留量未超過1μL（0.70mol/L）時，與不含乙醇的對照反應體系相比，擴增產物的信號衰減不明顯，PCR反應受到的抑制作用較弱（圖2）；當乙醇殘留量超過1μL（0.70mol/L）時，擴增產物的信號衰減明顯，PCR反應受到的抑制作用明顯增強；25 μL 反應體系中乙醇殘留量達到 2μL（1.39mol/L）時，PCR反應幾乎完全受到抑制；超過此濃度時，則PCR徹底被抑制。

圖2 乙醇對PCR反應的抑制作用

3 討 論

對轉基因產品的檢測主要是基于核酸的PCR檢測，轉基因產品的PCR檢測技術是國際認可的首選方法。基于常規PCR的轉基因成分檢測具有實驗流程長、中間步驟多、易污染等特點。雖然轉基因成分檢測技術發展較為成熟，但仍然存在很多問題，尤其是未商業化轉基因植物及產品的檢測以及轉基因產品DNA的分離與純化，這2個問題已經成為轉基因成分檢測的瓶頸。

目前已經商業化生產的轉基因產品種類多、數量大。轉基因產品生產過程中，一般都要經過若干道加工程序，原料的理化性質發生很大變化，營養成分重新搭配同時引入了各種添加劑，在很大程度上增加了DNA分離與純化的難度。常用的轉基因產品DNA的分離與純化方法主要有酚-三氯甲烷法、PVP法、CTAB法、硅土法、胍-三氯甲烷法等，其中三氯甲烷和乙醇是常用的2種有機試劑。乙醇易溶于水，DNA是水溶性物質，在DNA抽提中乙醇不易完全揮發，所以在轉基因成分檢測的后續PCR反應中往往殘留了一定量的乙醇。三氯甲烷幾乎不溶于水（25℃時，僅0.5%體積分數），但是由于在水相和有機相的分離、轉移過程中，DNA水溶液中往往混合了少量的三氯甲烷。高質量（高濃度、高純度）的DNA是PCR反應正常工作的首要條件，不含或者低含量的乙醇和氯仿等有機試劑的DNA模板直接影響轉基因成分檢測的成敗。實驗結果表明：當反應體系中存在的三氯甲烷摩爾濃度≥3.77 mol/L時，則會徹底抑制PCR的進行；和三氯甲烷相比，乙醇對PCR的抑制作用非常大，當在體系中加入1.39 mol/L的乙醇，就能使大部分DNA聚合酶失活從而抑制PCR反應，降低擴增效率。因此，在轉基因食品DNA提取過程中，要特別注意轉移DNA水相時不要吸到有機相，以免給后續步驟殘留更多的有機試劑。在轉基因食品DNA提取過程中，應多次純化，最大限度地減少三氯甲烷等有機試劑在核酸中的殘留。由于乙醚具有較強的揮發性，所以在轉基因食品DNA純化中，為了徹底除去DNA水溶液中殘留的三氯甲烷等有機試劑，可以加入少量的乙醚幫助溶解三氯甲烷等有機試劑，最后揮發完全。在DNA提取中乙醇的完全去除也是很關鍵的一個環節。乙醇是DNA熱聚合酶（蛋白質）的變性劑，PCR反應體系中乙醇的殘留將會降低擴增反應效率或者抑制擴增反應，所以在DNA純化完畢后應盡可能去除乙醇。

4 結束語

對轉基因產品的檢測方法主要是以針對外源蛋白的蛋白質檢測方法和以外源基因為對象的DNA檢測方法兩大類。因DNA檢測方法的準確性較高和適用范圍相對較大，所以在實際檢測工作中常用DNA檢測方法[7]。高質量的DNA是保證轉基因檢測準確的關鍵和前提，因此，在DNA的分離和純化過程中，應盡量減少三氯甲烷和乙醇等有機試劑的殘留，最大可能地減少它們對PCR反應的抑制作用。

[1] 賈士榮.轉墓因作物的安全性爭論及其對策[J].生物技術通報，1999（6）：1-7.

[2] James C.2002 Global review of commercialized transgenic crops[EB/OL].[2002-10-10].http：//www.isaaa.org，2002.

[3] Office of Food Additive Safety.U.S.food and drug administration[EB/OL].[2002-10-10].http：//www.fdacfsan/biotech-nology.

[4] 宋君，王東，劉勇，等.轉基因產品檢測技術標準存在的問題及建議[J].中國測試，2009，6（35）：88-90.

[5] GB/T 19495.3—2004轉基因產品檢測核酸提取純化方法[S].北京：中國標準出版社，2004.

[6] GB/T 19495.4—2004轉基因產品檢測核酸定性PCR檢測方法[S].北京：中國標準出版社，2004.

[7] 邵碧英，陳文，江樹勛，等.轉基因產品檢測方法概述[J].生物技術通報，2004，5（15）：516-518.