山楂葉總黃酮對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用研究

劉俊芳，連建學(xué)，李昌俊，鄭瑤，郭蓮軍（.河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院，洛陽市4700；.河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院，洛陽市 4700；.華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院，武漢市 4000）

山楂葉總黃酮（HLF）是從薔薇科山楂屬植物山里紅Crataegus pinnatifida Bge.Var.major N.E.Br或山楂G.pinnatifida Bge.的干燥葉中提取的活性成分。據(jù)國內(nèi)眾多文獻報道，HLF主要具有降低血脂[1]、抗氧化[2]、抗心肌缺血缺氧[3，4]、抗血栓和降血壓[5]等藥理作用。關(guān)于HLF抗心肌缺血的報道較多，但其抗腦缺血及對神經(jīng)細胞的保護作用少見報道。本文采用改良Zea Longa’s法復(fù)制大腦中動脈閉塞（MACO）模型，用神經(jīng)功能評分評價大鼠腦缺血再灌注后行為障礙；用2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色法測定梗死灶體積；用相應(yīng)試劑盒測定腦組織內(nèi)丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）含量及超氧化物歧化酶（SOD）活力，從整體、細胞等不同水平探討HLF抗腦缺血、保護神經(jīng)細胞的作用及可能機制，為腦缺血疾病的有效治療提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

680型酶標儀（美國Bio-Rad公司）；3500型臺式高速冷凍離心機（日本Kubota公司）；BI-2000型圖象分析系統(tǒng)（成都泰盟科技公司）；超低溫（－80℃）冰箱（美國Thermo Revco公司）；DHW-600型電熱恒溫水浴箱（北京路業(yè)通達科技有限公司）；CX31型光學(xué)顯微鏡、DP10型實體顯微鏡、AX 70型顯微照相裝置（日本Olympus公司）；G5型照相機（日本佳能公司）。

1.2 試藥

尼莫地平（德國拜耳公司，批號：BXCC80121）；HLF（晉城中晉藥業(yè)有限公司，批號：20071203，純度：95%）；白介素-1β（IL-1 β）放免藥盒（南京建成生物工程研究所，批號：20080627）；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）放免藥盒（北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司，批號：20080627）。

1.3 動物

SPF級成年健康SD大鼠72只，♂，體重190～260 g，由鄭州大學(xué)實驗動物中心提供（實驗動物許可證號：SCXK（豫）2005-0001）。室溫下適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實驗。

2 方法

2.1 模型的復(fù)制[6]

大鼠用10%水合氯醛（350 mg·kg-1）ip麻醉，仰臥固定，頸部正中線切口，沿胸鎖乳突肌內(nèi)緣鈍性分離肌肉和筋膜，直到分離出左側(cè)頸總動脈、頸外動脈、頸內(nèi)動脈，用動脈夾暫時夾閉頸內(nèi)動脈，結(jié)扎頸外動脈近心端及頸總動脈，然后在距頸總動脈近分叉3～4 mm處剪口，按體重選取適當直徑自制線栓（180～230 g∶0.235 mm；230～260 g∶0.26 mm）自切口輕輕插入，插入深度（從頸內(nèi)、外動脈分叉處計起）約為18～20 mm，固定魚線，縫合皮膚。缺血2 h后，將栓塞線向外輕輕拔出10 mm左右。

假手術(shù)組按上述方法，栓塞線僅插至頸內(nèi)、外動脈分叉處，而不阻塞大腦中動脈。在大鼠缺血再灌注期間進行Longa 5分制神經(jīng)功能學(xué)評分，各組大鼠均在24 h后斷頭取腦，并進行相應(yīng)的生化指標檢測。

2.2 分組和給藥

將SD大鼠隨機均分成6組，即模型（等容生理鹽水）、假手術(shù)（等容生理鹽水）、尼莫地平（0.7 mL·kg-1）和HLF高、中、低劑量（50、25、12.5 mg·kg-1）組。ip給藥，每天1次，連續(xù)給藥6次。隨機抽取各組其中6只大鼠用于通過神經(jīng)功能評分來評價大鼠腦缺血再灌注后行為障礙及測定缺血區(qū)腦組織內(nèi)MDA、NO含量和SOD活力；各組剩余的6只大鼠則采用TTC染色法測定梗死灶體積。

2.3 神經(jīng)學(xué)評分[6]及腦梗死體積[7]測定

大鼠清醒后，觀察其行為學(xué)變化，神經(jīng)癥狀按Longa 5分制評分。評分標準：0分，無神經(jīng)損傷癥狀；1分，不能完全伸展對側(cè)前爪；2分，向栓塞對側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分，行走時向?qū)?cè)傾倒；4分，不能自發(fā)行走，意識昏迷。分數(shù)越高，表示大鼠神經(jīng)功能障礙越嚴重。

腦缺血2 h再灌注24 h后，迅速斷頭處死大鼠，于冰盤上取腦，去除嗅球、小腦和低位腦干，分離左右半腦，取缺血側(cè)半腦，后沿冠狀面切成6～7片（約2 mm/片），立即置于2%TTC PBS中，37℃避光、溫浴10～15 min。取出腦片置10%福爾馬林液中固定24 h，正常腦組織為玫瑰紅色，梗死部位為白色。染色后的標本拍照，用BI-2000圖像分析系統(tǒng)處理，計算腦梗死體積占全腦體積的百分比。

2.4 大腦皮層及海馬區(qū)病理切片

腦缺血2 h再灌注24 h，大鼠經(jīng)心臟灌流固定后斷頭取腦，取缺血側(cè)相同區(qū)域大腦皮層和海馬區(qū)冠狀切塊，取中間切塊梯度脫水、透明、浸蠟、包埋。常規(guī)4 μm連續(xù)冠狀切片，隔四取一（間隔16 μm）為一套切片，進行HE染色。之后于光學(xué)顯微鏡下觀察大腦皮層和海馬區(qū)神經(jīng)元的病理形態(tài)學(xué)變化。

2.5 缺血側(cè)腦組織MDA、NO含量及SOD活力測定

大鼠復(fù)灌24 h后，斷頭取腦，剔除嗅球、小腦和低位腦干，在冰塊上分離左右兩側(cè)大腦。取缺血側(cè)半腦皮質(zhì)300～400 mg，制備成20%的腦勻漿，4 ℃下3 000 r·min-1離心15 min，離心后取上清液，－70℃保存，待測。按試劑盒說明測定MDA、NO含量及SOD活力。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。所有數(shù)據(jù)以x±s表示。多組資料采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 HLF對模型大鼠神經(jīng)行為障礙程度與腦梗死體積的影響

HLF高、中劑量組能顯著改善模型大鼠神經(jīng)行為障礙（P＜0.05），HLF低劑量組未能顯著改善模型大鼠神經(jīng)行為障礙；HLF高、中劑量組能顯著減少腦梗死體積（P＜0.01），HLF低劑量組的腦梗死體積與模型組比較無顯著差異。以上結(jié)果提示HLF干預(yù)效果與劑量呈正相關(guān)。TTC染色結(jié)果比較見圖1；HLF對模型大鼠神經(jīng)行為障礙程度與腦梗死體積的影響見表1（假手術(shù)組略去）。

圖1 TTC染色結(jié)果比較A.假手術(shù)組（400×）；B.模型組（400×）；C.尼莫地平組（400×）；D.HLF低劑量組（400×）；E.HLF中劑量組（400×）；F.HLF高劑量組（400×）；a.假手術(shù)組（100×）；b.模型組（100×）；c.尼莫地平組（100×）；d.HLF低劑量組（100×）；e.HLF中劑量組（100×）；f.HLF高劑量組（100×）Fig1 Comparison of the results of TTC stainingA.sham group（400×）；B.model group（400×）；C.nimodipine group（400×）；D.HLF low-dose group（400×）；E.HLF middle-dose group（400×）；F.HLF high-dose group（400×）；a.sham group（100×）;b.model group（100×）；c.nimodipine group（100×）；d.HLF low-dose group（100×）；e.HLF middle-dose group（100×）；f.HLF high-dose group（100×）

表1 HLF對模型大鼠神經(jīng)行為障礙程度與腦梗死體積的影響（±s，n＝6）Tab1 Effects of total flavonoids of Folium Crataegi on ethological score and volume of cerebral infarction in model rat（±s，n＝6）

表1 HLF對模型大鼠神經(jīng)行為障礙程度與腦梗死體積的影響（±s，n＝6）Tab1 Effects of total flavonoids of Folium Crataegi on ethological score and volume of cerebral infarction in model rat（±s，n＝6）

與模型組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.model group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別模型組尼莫地平組HLF低劑量組HLF中劑量組HLF高劑量組腦梗死體積比/%15.77±2.67 2.91±3.11＊10.55±2.38 6.02±7.67＊3.33±3.87＊行為學(xué)評分缺血2 h 2.67±0.52 1.83±0.41＊2.50±0.55 2.00±0.63＊1.67±0.52＊＊再灌注后24 h 3.17±0.75 1.50±0.55＊＊3.00±0.63 1.67±0.52＊＊1.67±1.21＊＊

3.2 HLF對模型大鼠皮層及海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)的影響

假手術(shù)組大腦皮層HE染色神經(jīng)元核仁及胞質(zhì)形態(tài)和結(jié)構(gòu)正常，神經(jīng)元呈圓形或橢圓形，胞體較大，染色質(zhì)分布均勻著色深，神經(jīng)細胞排列緊密。模型、尼莫地平和HLF高、中、低劑量組低倍鏡（100×）下，缺血中心區(qū)腦組織結(jié)構(gòu)變得疏松，呈空隙狀或有空腔形成，著色較淺可見炎性細胞；高倍鏡（400×）下可見神經(jīng)細胞數(shù)明顯減少，部分神經(jīng)細胞只留其輪廓，胞質(zhì)嗜酸性增強，核固縮深染，核仁和尼氏體消失，胞質(zhì)少著色深，與周圍神經(jīng)組織有較大腔隙，總體表現(xiàn)為核固縮、碎裂、溶解等細胞壞死的特征。尼莫地平和HLF高、中、低劑量組神經(jīng)細胞損傷程度均輕于模型組，其中以尼莫地平和HLF高劑量組改善最為明顯。

假手術(shù)組海馬結(jié)構(gòu)正常，錐體細胞排列整齊，形態(tài)正常，細胞著色均勻，胞漿呈淡紅色，胞核呈藍色且清亮。模型組海馬組織結(jié)構(gòu)明顯異常，錐體細胞排列紊亂，細胞間隙增寬，神經(jīng)元變性明顯。部分退變的神經(jīng)元呈現(xiàn)凋亡特征：細胞皺縮成圓形或卵圓形；核染色質(zhì)固縮、邊集或碎裂；胞漿皺縮，嗜酸性增加。亦可見均質(zhì)紅染壞死物質(zhì)和細胞核固縮、溶解等壞死特征。尼莫地平和HLF高、中、低劑量組神經(jīng)細胞排列略紊亂，仍可見細胞皺縮和胞核固縮濃染現(xiàn)象，但程度較模型組明顯減輕，其中以尼莫地平和HLF高劑量組改善最為明顯。大鼠皮層和海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)見圖2。

圖2 大鼠皮層和海馬神經(jīng)元細胞形態(tài)學(xué)（HE染色）A.假手術(shù)組；B.模型組；C.尼莫地平組；D.HLF低劑量組；E.HLF中劑量組；F.HLF高劑量組Fig2 Morphologic changes in cortex and hippocampus of model rats（HE staining）A.sham group； B.model group； C.nimodipine group； D.HLF low-dose group；E.HLF middle-dose group；F.HLF high-dose group

3.3HLF對模型大鼠缺血側(cè)腦組織內(nèi)MDA、NO含量及SOD活力的影響

與假手術(shù)組比較，模型組缺血腦組織內(nèi)的MDA、NO含量顯著升高，SOD活力顯著降低（P＜0.01）；尼莫地平和HLF高、中、低劑量組缺血側(cè)腦組織內(nèi)MDA、NO含量顯著降低，SOD活力增強（P＜0.01或P＜0.05），而且隨著HLF劑量的增加，MDA、NO含量遞減，SOD活力遞增。HLF對模型大鼠缺血側(cè)腦組織中MDA、NO含量及SOD活力的影響見表2。

4 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，HLF高、中劑量組能明顯減少腦梗死體積（P＜0.01）；明顯改善模型大鼠神經(jīng)行為障礙（P＜0.05），且與尼莫地平組無明顯差異；HLF亦可以改善因缺血引起的大腦皮層和海馬區(qū)神經(jīng)元的病理損傷，且HLF干預(yù)效果具有劑量依賴性。

腦缺血再灌注損傷是多因素參與的復(fù)雜的病理生理過程。一般認為與氧自由基生成過多、組織脂質(zhì)過氧化、細胞內(nèi)鈣超負荷、興奮性氨基酸（EAA）毒性、線粒體功能受損關(guān)系密切。缺血再灌注后，黃嘌呤氧化酶產(chǎn)生增多、中性粒細胞激活以及線粒體內(nèi)單電子還原等原因，導(dǎo)致大量氧自由基產(chǎn)生。而自由基的過多生成是引起脂質(zhì)過氧化、細胞內(nèi)鈣超載、EAA釋放增加的關(guān)鍵因素，進而可引起不可逆損傷[7]。自由基可廣泛攻擊富含不飽和脂肪酸的神經(jīng)膜與血管，引發(fā)脂質(zhì)過氧化瀑布效應(yīng)，產(chǎn)生堿基重新修飾、多核苷酸鏈斷裂、蛋白質(zhì)變性、多糖分子聚合或降解，使細胞結(jié)構(gòu)的完整性被破壞，細胞膜的通透性改變、離子轉(zhuǎn)運異常。細胞內(nèi)鈣超載可進一步損傷線粒體的功能，Ca2+還能激活鈣依賴蛋白激酶，使胞內(nèi)無害的黃嘌呤脫氫酶轉(zhuǎn)變?yōu)辄S嘌呤氧化酶，生成大量氧自由基。另外，Ca2+也可活化iNOS，催化產(chǎn)生NO。NO增加具有雙重作用，既有神經(jīng)保護作用，又有神經(jīng)毒性作用[8]。在缺血再灌注早期，NO有擴張血管、改善缺血組織血供、抑制血小板凝集、減輕缺血及再灌注損傷的作用；而在缺血再灌注后期，iNOS在腦缺血后的炎癥細胞部位表達，產(chǎn)生大量的NO，其可與超氧陰離子形成過氧化亞硝酸，滅活線粒體的錳超氧化物歧化酶，促進大量自由基生成，介導(dǎo)氧化損傷，發(fā)揮細胞毒性作用。同時，NO也是極強的氧化劑，能直接氧化脂質(zhì)，造成細胞損傷[9，10]。綜上所述，自由基的過多生成、脂質(zhì)過氧化、細胞內(nèi)鈣超載、EAA釋放增加、NO細胞毒性作用等諸多因素相互促進，形成惡性循環(huán)，進而造成不可逆的細胞損傷。

表2 HLF對模型大鼠缺血側(cè)腦組織中MDA、NO含量及SOD活力的影響Tab2 Effects of total flavonoids of Folium Crataegi on the levels of MDA and NO and SOD activity in ischemic side of brain in rats with cerebral ischemic-reperfusion injury

MDA是脂質(zhì)過氧化過程中生成的醛類物質(zhì)之一，其可作為交聯(lián)劑促進核酸、蛋白質(zhì)及磷脂的交聯(lián)，改變生物大分子的功能，通過檢測MDA的含量可以反映脂質(zhì)過氧化的程度。在正常情況下，機體中有抗氧化酶的廣泛分布，在防止氧代謝物的損傷中具有重要作用，這些抗氧化酶主要是SOD、過氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）等多種自由基代謝酶。SOD可催化超氧自由基發(fā)生歧化反應(yīng)，清除氧自由基，保護生物膜免受自由基的傷害[11]。生理情況下，氧自由基與氧化防御系統(tǒng)兩者保持動態(tài)平衡。有文獻[12，13]通過對能過度表達銅-鋅超氧化物歧化酶的轉(zhuǎn)基因小鼠研究腦缺血再灌注損傷情況時發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠比較，轉(zhuǎn)基因鼠神經(jīng)細胞凋亡減少，故可推測提高缺血組織內(nèi)SOD水平、加強氧自由基的清除，對缺血再灌注損傷的減輕以及損傷修復(fù)是有益的。

本研究發(fā)現(xiàn)，HLF能明顯降低缺血腦組織內(nèi)MDA、NO含量，增強SOD活力，且具有劑量依賴性。提示HLF很可能通過減少自由基的生成、抑制脂質(zhì)過氧化、加速自由基的清除、降低NO的細胞毒性，從而對腦缺血再灌注損傷有較好的保護作用。

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