舒筋通絡(luò)外用顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

潘志文（廣東佛山市藥品檢驗(yàn)所，佛山市 528000）

舒筋通絡(luò)外用顆粒為佛山市順德區(qū)龍江醫(yī)院的外用制劑，處方由大黃、當(dāng)歸、桂枝、獨(dú)活等13味藥材組成，其中大黃、當(dāng)歸、桂枝、獨(dú)活以細(xì)粉入藥，其余藥味用水煎煮提取，提取液濃縮后與上述細(xì)粉混勻，制成顆粒。其用溫水溶解后薰洗患處，具有溫經(jīng)通絡(luò)、祛瘀止痛之功，用于治療跌打損傷、筋骨疼痛、關(guān)節(jié)不利。為了控制該制劑質(zhì)量，筆者采用薄層色譜（TLC）法對(duì)方中大黃、當(dāng)歸、桂枝、獨(dú)活作定性鑒別，采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定主藥大黃有效成分大黃素和大黃酚的含量。

1 儀器與試藥

1100型HPLC儀，包括Agilent化學(xué)工作站（美國(guó)Agilent公司）；AE240電子分析天平（瑞士Mettler Toleto公司）；KQ300超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，頻率：40 kHz，功率：300 W）。

大黃、當(dāng)歸、桂枝、獨(dú)活對(duì)照藥材和大黃素、大黃酚對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)分別為9022-200207、9271-200110、1191-200101、0940-200205、110756-200110、110796-200311）；舒筋通絡(luò)外用顆粒樣品（批號(hào)：0701、0702、0703）及陰性樣品均由佛山市同德區(qū)龍江醫(yī)院提供；薄層層析硅膠G（化學(xué)純，青島海洋化工集團(tuán)公司）；甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 定性鑒別

2.1 當(dāng)歸、桂枝、獨(dú)活的TLC鑒別[1]

取本品3 g，研細(xì)，加乙醚40 mL，超聲處理10 min，濾過(guò)，濾液置分液漏斗中，用0.1 mol·L-1氫氧化鈉溶液洗滌3次，每次20 mL，洗液合并，備用，乙醚液再用水10 mL洗滌1次，揮干，殘?jiān)訜o(wú)水乙醇1 mL使溶解，作為供試品溶液；取當(dāng)歸對(duì)照藥材0.8 g、桂枝對(duì)照藥材0.2 g、獨(dú)活對(duì)照藥材0.5 g，分別加乙醚30 mL，超聲處理10 min，濾過(guò)，濾液揮干，殘?jiān)訜o(wú)水乙醇1 mL使溶解，作為相應(yīng)的對(duì)照藥材溶液；分別取缺當(dāng)歸、缺桂枝、缺獨(dú)活的陰性樣品各3 g，按供試品溶液的制備方法制成相應(yīng)的陰性對(duì)照溶液。照TLC法[1]試驗(yàn)，吸取上述7種溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以石油醚（30～60 ℃）-甲酸乙酯-甲酸（15∶5∶1）的上層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與當(dāng)歸對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的亮藍(lán)白色熒光斑點(diǎn)；在與桂枝對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的綠色熒光斑點(diǎn)；在與獨(dú)活對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的藍(lán)紫色熒光斑點(diǎn)；陰性對(duì)照無(wú)干擾。當(dāng)歸、桂枝、獨(dú)活的TLC見(jiàn)圖1。

2.2 大黃的TLC鑒別[1]

取“2.1”項(xiàng)下備用之洗液適量，用1 mol·L-1鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至1～2，用乙醚提取3次，每次20 mL，合并提取液，揮干，殘?jiān)訜o(wú)水乙醇5 mL使溶解，作為供試品溶液；取大黃對(duì)照藥材0.1 g，加乙醚30 mL，超聲處理10 min，濾過(guò)，濾液揮干，殘?jiān)訜o(wú)水乙醇1 mL使溶解，作為對(duì)照藥材溶液；取缺大黃陰性樣品3 g，按供試品溶液的制備方法制成陰性對(duì)照溶液。照TLC法[1]試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以石油醚（30～60℃）-甲酸乙酯-甲酸（15∶5∶1）的上層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的5個(gè)橙黃色熒光主斑點(diǎn)；陰性對(duì)照無(wú)干擾。大黃的TLC見(jiàn)圖2。

圖1 當(dāng)歸、桂枝、獨(dú)活的TLC1～3.供試品；4.當(dāng)歸對(duì)照藥材；5.桂枝對(duì)照藥材；6.獨(dú)活對(duì)照藥材；7.缺當(dāng)歸陰性對(duì)照；8.缺桂枝陰性對(duì)照；9.缺獨(dú)活陰性對(duì)照Fig1 TLC of Angelica sinensis，Cinnamomum cassia and A.pubescens1～3.test samples；4.Angelicae Sinensis Radix reference substance；5.Cinnamomi Ramulus reference substance；6.Angelicae Pubescentis Radix reference substance；7.negative control without A.Sinensis；8.negative control without C.cassia；9.negative control withoutA.Pubescentis

圖2 大黃的TLC1～3.供試品；4.大黃對(duì)照藥材；5.缺大黃陰性對(duì)照Fig2 TLC of Rhei Radix Et Rhizoma1～3.test samples；4.Rhei Radix et Rhizoma reference substance；5.negative control without Rhei Radix Et Rhizoma

3 含量測(cè)定[2]

3.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil ODS2（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸溶液（85∶15）；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

3.2 溶液的制備

3.2.1 供試品溶液的制備 取本品適量，研細(xì)，取約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，濾過(guò)。精密量取續(xù)濾液5 mL，置燒瓶中，揮去溶劑，加8%鹽酸溶液10 mL，超聲處理2 min，再加三氯甲烷10 mL，加熱回流1 h，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗滌容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10 mL，合并三氯甲烷液，減壓回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状际谷芙猓D(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

3.2.2 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取大黃素對(duì)照品和大黃酚對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含大黃素10 μg、大黃酚25 μg的混合溶液，即得。

3.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備 取缺大黃陰性樣品適量，按“3.2.1”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液。

3.3 空白試驗(yàn)

取上述混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各適量，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，陰性對(duì)照溶液在大黃素、大黃酚對(duì)照品色譜峰相應(yīng)的位置上無(wú)干擾峰。色譜見(jiàn)圖3。

3.4 線性關(guān)系考察

精密吸取混合對(duì)照品溶液 1、2、5、10、20、50 μL，注入HPLC儀，按上述色譜條件測(cè)定。分別以大黃素、大黃酚進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程分別為Y大黃素＝3 737.4X大黃素－1.365 9（r＝0.999 9，n＝6）、Y大黃酚＝5 224.3X大黃酚－3.870 6（r＝0.999 9，n＝6）。結(jié)果表明，大黃素、大黃酚進(jìn)樣量分別在0.01～0.50、0.025～1.250 μg范圍內(nèi)與各自峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

3.5 精密度試驗(yàn)

圖3 高效液相色譜圖A.混合對(duì)照品；B.供試品；C.陰性對(duì)照；1.大黃素；2.大黃酚Fig3 HPLC chromatogramsA.mixed control；B.test sample；C.negative control；1.emodin，2.chrysophanol

精密吸取混合對(duì)照品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，按上述色譜條件測(cè)定。結(jié)果，大黃素、大黃酚峰面積的RSD均為0.2%（n均為6），表明儀器精密度良好。

3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取供試品溶液，分別于0、1、2、3、4、24 h注入HPLC儀，按上述色譜條件測(cè)定。結(jié)果，大黃素峰面積的RSD＝0.2%，大黃酚峰面積的RSD＝0.1%（n均為6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批樣品適量，共6份，按“3.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定，記錄峰面積；另精密吸取混合對(duì)照品溶液10 μL，同法測(cè)定，外標(biāo)法計(jì)算大黃素和大黃酚含量。結(jié)果，大黃素和大黃酚平均含量的RSD分別為1.3%和1.4%（n均為6），表明方法重復(fù)性良好。

3.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品（含大黃素0.665 4 mg·g-1、大黃酚1.640 mg·g-1）6份，各約0.5 g，精密稱定，分別精密加入對(duì)照品溶液（含大黃素 50.00 μg·mL-1、大黃酚125.00 μg·mL-1）各 5 mL，混勻，水浴蒸干，按“3.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定，記錄峰面積；另精密吸取混合對(duì)照品溶液10 μL，同法測(cè)定，外標(biāo)法計(jì)算樣品含量，并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

3.9 樣品含量測(cè)定

取3批樣品適量，分別按“3.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定，記錄峰面積；另精密吸取對(duì)照品溶液10 μL，同法測(cè)定，用外標(biāo)法計(jì)算樣品中大黃素和大黃酚的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

4 討論

因大黃的5個(gè)蒽醌類成分對(duì)當(dāng)歸、桂枝、獨(dú)活的TLC鑒別有干擾，故先用0.1 mol·L-1的氫氧化鈉溶液將其分離出去。曾用石油醚（60～90℃）-醋酸乙酯（4∶1）為展開(kāi)劑對(duì)供試品溶液進(jìn)行薄層層析，但當(dāng)歸的色譜斑點(diǎn)與桂枝的色譜斑點(diǎn)分離度欠佳，當(dāng)選用大黃的TLC展開(kāi)劑系統(tǒng)時(shí)，當(dāng)歸、桂枝、獨(dú)活的色譜成分均能達(dá)到有效分離。大黃的蒽醌類成分用0.1 mol·L-1的氫氧化鈉溶液分離出來(lái)后，用1 mol·L-1鹽酸溶液酸化，再用乙醚進(jìn)行提取，制得的供試品溶液與當(dāng)歸、桂枝、獨(dú)活的鑒別同板展開(kāi)。一塊板同時(shí)鑒別4個(gè)藥材成分，方便、省時(shí)。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 1Results of recovery tests（n＝6）

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果Tab2 Results of content determination

本品處方由13味中藥組成，其中大黃為主藥，大黃素和大黃酚是其主要有效成分，故選其為含量測(cè)定指標(biāo)。參照2010年版《中國(guó)藥典》（一部）“大黃”項(xiàng)下收載的含量測(cè)定方法，采用HPLC法測(cè)定兩者的總量。結(jié)果表明，在選定的色譜條件下，其他成分不干擾大黃素和大黃酚的測(cè)定，系統(tǒng)的適用性、方法回收率符合要求，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好。

按2010年版《中國(guó)藥典》（一部）“大黃”項(xiàng)下的質(zhì)量要求，結(jié)合本制劑大黃的處方量，暫訂本品每袋含大黃按大黃素和大黃酚的總量計(jì)，不得少于13.0 mg。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì)編.中華人民共和國(guó)藥典（一部）[S].2010年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄34、22、124、246、259.

[2]郭 澄，王雯佶，江春霞，等.高效液相色譜法測(cè)定減肥降脂片中大黃酸、大黃素的含量[J].中國(guó)藥房，2003，14（4）：241.