粗毛牛膝帶腋芽莖段的植株再生研究

劉葉蔓，謝果珍（湖南中醫藥大學，長沙市 410208）

粗毛牛膝Achyranthes bindentataBL.是莧科多年生草本植物。其根、種子、莖和葉中含有蛻皮甾酮、土牛膝皂苷、生物堿等。藥理研究表明，其不同溶劑提取物在強心、抗生育、抗菌和癌細胞凋亡等方面有明顯的影響[1]。植物組織和細胞培養技術的發展為藥用植物有效成分的工廠化生產提供了一條有效的途徑。近年來，關于懷牛膝、川牛膝組織培養方面的研究已有報道[2～4]，但至今仍無粗毛牛膝在組織培養方面的報道。因此，筆者對粗毛牛膝的組織培養進行了初步研究，并獲得了再生植株。

1 儀器與材料

1.1 儀器

AF1004型電子天平（上海精密科學儀器有限公司）；DNP-9052型電熱恒溫培養箱（中新醫療儀器有限公司）；KQ5200DB型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；超凈工作臺（蘇州三興凈化科技有限公司）。

1.2 試藥

基本培養基、萘乙酸（NAA）、6-芐基嘌呤（6-BA）均由上海艾研生物科技有限公司提供。

1.3 外植體

以粗毛牛膝帶腋芽的嫩莖為外植體。

2 方法

2.1 外植體及處理

外植體經流水沖洗30 min、洗衣粉液浸洗5 min、清水清洗后，在超凈工作臺用75%的酒精振蕩浸潤2 min，用無菌水清洗4次，再用0.1%氯化汞消毒15 min，最后用無菌水清洗5次后接種在培養基上。

2.2 培養基及激素配比

選用L9（34）正交設計，根據試驗號分別考察基本培養基（A）、NAA濃度（B）和6-BA濃度（C）3個因素對莖段和腋芽生長的影響。每個試驗號重復20次，每瓶接種4塊，40 d后統計分析結果。計算公式：腋芽生長系數＝腋芽長度（cm）總和/（接種塊數－感菌塊數）。因素水平見表1。

表1 因素水平Tab1 Factors and levels

2.3 根的誘導

切取生長的腋芽尖端1.5 cm左右接種在1/2MS+0.5 mg·L-1NAA培養基上。

2.4 培養條件

以上培養溫度均為（25±1）℃，1 500 lx光照12 h·d-1，12 h·d-1黑暗。培養基中均含3%蔗糖、0.65%瓊脂。pH 5.5～5.8。

3 結果

3.1 基本培養基及激素配比對莖段和腋芽生長的影響

正交試驗結果見表2；方差分析結果見表3。

表2、表3結果表明，影響因素順序是A＞C＞B。A因素（基本培養基）和C因素（6-BA濃度）對腋芽生長各水平之間具有顯著意義，B因素（NAA濃度）沒有顯著性意義。結合實際，最佳培養基組合是A1B1C2，即以MS為基本培養基，添加0.1 mg·L-1NAA和0.5 mg-1L-16-BA，有利于腋芽的萌發和生長。因A1B1C2在正交表找不到，故應作驗證試驗。

3.2 驗證試驗

根據A1B1C2配比配制培養基，其他條件同“2.4”項下，接種20瓶，每瓶接種塊數4塊，40 d統計結果，可得腋芽生長系數達10.210，比表2中最高者（字列號1）還高，表明A1B1C2為最佳培養基組合。

3.3 生根情況

以1/2MS+0.5 mg·L-1NAA培養基能有效誘導已萌發腋芽的生根，根的數量均在10條以上，生長健壯。

4 討論

表2 正交試驗結果Tab2 Results of orthogonal test

表3 方差分析結果Tab3 Results of variance analysis

筆者考察基本培養基、NAA濃度和6-BA濃度不同配比對粗毛牛膝帶腋芽莖段生長的影響。結果表明，基本培養基MS、6-BA濃度對腋芽的生長有顯著影響，最佳的培養基組合為MS+0.1 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-16-BA，這與文獻[5]對川牛膝的研究結果一致。通過驗證試驗可知，在NAA濃度為0.1 mg·L-1時，適當增加6-BA的濃度，有利于腋芽的生長。在7號試驗中，當6-BA達到1.0 mg·L-1時，腋芽生長系數明顯降低。說明在一定濃度范圍內，較高的6-BA/NAA比值有利于芽的分化和生長，這與文獻[6]研究結果一致：在其他因子不變的情況下，細胞分裂素所含濃度越高，叢生芽啟動越快，數量也較多，由此看來細胞分裂素對誘導粗毛牛膝外植體脫分化有關鍵作用。本研究中，不定芽在1/2MS+0.5 mg·L-1NAA培養基上100%生根，且幼根生長健壯，說明粗毛牛膝不定芽誘導生根能力強。本研究結果可為粗毛牛膝的生物技術利用提供理論依據。

[1]蔡光先.湖南藥物志[M].長沙：湖南科學技術出版社，2004：79.

[2]李明軍，于相麗，陳明霞，等.懷牛膝愈傷組織的誘導和植株再生[J].植物生理學通訊，2004，40（3）：343.

[3]張麗萍，董誠明，金蓋宇.懷牛膝組織培養及齊墩果酸定量分析的研究[J].河南中醫學院學報，2003，7（4）：32.

[4]李明軍，李 萍，洪森榮，等.懷牛膝愈傷組織誘導及分化的研究[J].河南師范大學學報（自然科學版），2005，33（4）：118.

[5]劉 堅，張 挺，陳德茜，等.川牛膝組織培養快繁技術研究[J].中藥材，2006，29（5）：425.

[6]蔣澤平，梁珍海，李 勁，等.雜交鵝掌楸的離體培養和植株再生研究[J].江蘇林業科技，2004，31（6）：5.