美寶濕潤燒傷膏對大鼠深Ⅱ度燙傷創面的保護作用研究

張莉，高志軍，趙靜（.西藏大學醫學院，拉薩市850000；.西藏當雄縣人民醫院，當雄縣85500）

嚴重燒燙傷早期因腸黏膜屏障功能受損會導致腸道細菌和內毒素移位，激活炎癥以及后續的代償性抗炎反應和免疫系統自我保護作用，最終導致機體免疫失衡，從而引起全身炎癥反應綜合征（Systemic inflammatory response syndrome，SIRS），進而導致多器官功能障礙綜合征（Multiple Organs Dysfunction syndrome，MODS）。國外研究證實，大鼠Toll樣受體4（TLR4）信號通路及下游相關的效應分子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）參與了燒傷后炎癥的發生[1]。有研究發現，作為TLR4的配體脂多糖（LPS）也在燒傷后續炎癥反應中發揮著重要的作用[2，3]。

美寶濕潤燒傷膏（MEBO）主要成分包括黃連、黃柏、黃芩、地龍、罌粟殼，具有清熱、解毒、止痛、生肌功效，廣泛用于治療各種燒、燙、灼傷。在本研究中，筆者將MEBO運用于燙傷大鼠，觀察其對燙傷大鼠創面愈合和TLR4/LPS信號通路及TNF-α、IL-6的影響，初步闡明其對燙傷后炎癥的相關作用機制，為燒燙傷創面愈合的臨床治療提供理論依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

FACS Calibur型流式細胞儀（美國BD公司）；680型全波長酶標檢測儀（美國Bio-Rad公司）；721型分光光度計（上海菁華科技儀器有限公司）；內毒素檢測試劑（鱟試劑）動態檢測儀（北京時代新光生物技術有限公司）。

1.2 試藥

MEBO（汕頭市美寶制藥有限公司，批號：Z20000004）；鱟試劑（上海坤肯生物化工有限公司）；PE標記的大鼠TLR4單克隆抗體、FITC標記的鼠免疫球蛋白G（IgG）均購自美國BD公司；紅細胞裂解液、TNF-α、IL-6 ELISA檢測試劑盒（深圳晶美生物技術公司）。

1.3 動物

大鼠30只，♂，體重280～320 g，由第三軍醫大學實驗動物中心提供（動物合格證號：24301050）。

2 方法

2.1 模型的復制和分組、給藥

將30只SD大鼠隨機均分為空白對照、模型對照和MEBO組。除空白對照組外，其它大鼠在清醒狀態下，以200 g·L-1硫化鈉背部脫毛；200 g·L-1的烏拉坦溶液按5 mL·kg-1ip麻醉，置電熱恒浴中致背部燙傷（108℃，8 s），復制深Ⅱ度（經病理證實）燙傷模型，燙傷后ip生理鹽水（40 mL·kg-1）抗休克。創面處理方式：模型對照組大鼠燙傷后讓創面暴露；MEBO組大鼠燙傷后涂MEBO于創面（厚度薄于1 mm），每8 h更換新藥。注意換藥前需將殘留在創面上的藥物及液化物拭去，同時暴露創面。燙傷后大鼠分籠飼養。觀察期間未發生明顯感染癥狀。

2.2 標本收集

將空白對照和MEBO組大鼠在燙傷后各時相點麻醉，無菌條件下經尾靜脈采集靜脈血，一部分置于去熱源肝素化試管中，3 000 r·min-1、4℃下收集血漿；一部分置于去內毒素的干凈試管中自凝，3 000 r·min-1、4℃下收集血清。樣本于－70℃貯藏，備用。

2.3 大鼠創面愈合情況觀察

每日觀察傷口愈合情況，以創面完全上皮化、無滲出作為創面完全愈合依據，同時記錄創面愈合時間；按Nagelschmidt法[6]計算各時相點創面愈合率：用透明稱量紙（7.5 cm×7.5 cm，平均重量約為0.156 8 g）覆蓋于大鼠背部創面，將創面邊緣清晰描繪在透明稱量紙上，僅保留曲線繪制所圍的面積并稱重。創面面積＝（7.5 cm×7.5 cm×紙片重）/0.156 8 g；創面愈合率/%＝（原始創面面積－未愈合創面面積）/原始創面面積×100%。

2.4 LPS檢測

參考鱟試劑檢測說明書，采用濁度法（內毒素檢測法）檢測各組大鼠血漿中內毒素含量。其原理是當被檢測的樣品中含有內毒素時，鱟試劑會變混濁。內毒素含量與混濁程度呈正比，可準確量化被檢測樣品中內毒素的含量。顯色后采用分光光度計于540 nm波長處測定吸光度值。根據標準曲線求得大鼠血漿中LPS含量。

2.5 ELISA檢測

采用ELISA檢測大鼠血清中TNF-α、IL-6的表達水平，按說明書進行操作。

2.6 流式細胞術檢測

抽取EDTA抗凝靜脈血2 mL，采用細胞分離柱方法進行，在無菌情況下采用淋巴細胞分離液方法分離淋巴細胞，熒光抗體標記的淋巴細胞懸液4℃條件下避光孵育30 min，PBS洗滌3次，每次5 min。取1×106個·mL-1細胞標記的抗TLR4-PE單克隆抗體和抗FITC-IgG單克隆抗體，上流式細胞儀進行檢測。

2.7 統計學方法

所有計量資料均采用±s表示；TNF-α含量、IL-6含量用χ2檢驗行統計學分析；LPS含量用t檢驗及單因素方差分析。采用SPSS 11.0軟件進行統計，P＜0.05為差異有顯著性。

3 結果

3.1 各組大鼠創面愈合時間及不同時相點創面愈合率

相對于模型對照組[（22.83±2.82）d]，MEBO組大鼠創面愈合時間[（17.25±1.78）d]顯著縮短（P＜0.01）。各組大鼠創面愈合時間見表1。

表1 各組大鼠創面愈合時間（±s，n＝10）Tab1 Healing time of wound in each grou（±s，n＝10）

表1 各組大鼠創面愈合時間（±s，n＝10）Tab1 Healing time of wound in each grou（±s，n＝10）

與模型對照組比較：＊P＜0.01vs.model control group：＊P＜0.01

創面愈合時間/d 22.83±2.82 17.25±1.78＊組別模型對照組MEBO組

在傷后的前3天，MEBO組大鼠與模型對照組比較，創面愈合率無顯著差異（P＞0.05）；從第7天至第21天，MEBO可明顯促進燙傷大鼠的創面愈合（P＜0.01或P＜0.05）。不同時相點各組大鼠創面愈合率見表2。

3.2 各組大鼠血漿中LPS含量變化

表2 不同時相點各組大鼠創面愈合率（±s，n＝10）Tab2 Healing rate of wound in each group at different time point（±s，n＝10）

表2 不同時相點各組大鼠創面愈合率（±s，n＝10）Tab2 Healing rate of wound in each group at different time point（±s，n＝10）

與模型對照組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.model control group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別模型對照組MEBO組不同時相點的愈合率/%28 d 100 100 1 d 2.03±0.32 1.98±0.30 3 d 10.69±2.32 11.84±3.89 7 d 36.87±6.25 41.88±8.03＊14 d 70.56±12.20 85.46±13.74＊＊21 d 92.07±14.64 100＊＊

傷后第1天至第7天，模型對照組大鼠血漿中LPS含量逐漸升高，于第7天達到頂峰后逐漸降低；與模型對照組比較，從第7天至第21天，不同時相點MEBO可顯著降低燙傷大鼠血漿中LPS含量（P＜0.01或P＜0.05）。不同時相點各組大鼠血漿LPS含量變化見表3。

3.3 傷后各組大鼠血清中TNF-α和IL-6含量變化

表3 不同時相點各組大鼠血漿LPS含量變化（±s，n＝10）Tab3 The content of LPS in rat plasma at different time point（±s，n＝10）

表3 不同時相點各組大鼠血漿LPS含量變化（±s，n＝10）Tab3 The content of LPS in rat plasma at different time point（±s，n＝10）

與模型對照組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.model control group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別模型對照組MEBO組不同時相點的LPS含量/μg·mL-1 28 d 0.73±0.17 0.69±0.18 1 d 0.70±0.11 0.73±0.10 3 d 0.72±0.14 0.69±0.12 7 d 1.23±0.34 0.91±0.26＊＊14 d 0.98±0.22 0.76±0.19＊＊21 d 0.85±0.18 0.71±0.16＊

第1天至第28天，模型對照組大鼠血清中TNF-α的水平逐漸降低；與模型對照組比較，從第7天至第28天，MEBO可有效降低燙傷模型大鼠血漿中TNF-α含量（P＜0.01或P＜0.05）。不同時相點各組大鼠血清TNF-α含量變化見表4。

表4 不同時相點各組大鼠血清TNF-α含量變化（±s，n＝10）Tab 4The content of TNF-α in rat plasma at different time point（±s，n＝10）

表4 不同時相點各組大鼠血清TNF-α含量變化（±s，n＝10）Tab 4The content of TNF-α in rat plasma at different time point（±s，n＝10）

與模型對照組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.model control group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

模型對照組MEBO組0.56±0.19 0.43±0.13＊＊1.38±0.35 1.43±0.38 0.98±0.27 0.93±0.26 0.78±0.18 0.61±0.20＊0.70±0.22 0.58±0.18＊0.63±0.21 0.51±0.16＊＊

模型對照組大鼠血清中IL-6于第3天達到最高峰，隨后緩慢下降；經MEBO處理后，大鼠血清中IL-6的表達水平于第7天開始顯著下降（P＜0.01或P＜0.05）。不同時相點各組大鼠血清IL-6含量變化見表5。

表5 不同時相點各組大鼠血清IL-6含量變化（±s，n＝10）Tab5 The content of IL-6 in rat plasma at different time points（±s，n＝10）

表5 不同時相點各組大鼠血清IL-6含量變化（±s，n＝10）Tab5 The content of IL-6 in rat plasma at different time points（±s，n＝10）

與模型對照組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.model control group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

模型對照組MEBO組110.00±21.44 108.41±21.96 105.33±20.63 104.01±21.63 143.45±23.26 145.54±22.90 135.69±21.77 128.95±20.10＊123.33±20.47 117.63±19.92＊118.88±20.85 109.79±18.64＊＊

3.4 各組大鼠外周血中TLR4百分率變化

模型對照組大鼠外周血中TLR4百分率逐漸升高，第14天達到最高峰，隨后緩慢下降；與模型對照組比較，MEBO組大鼠外周血中TLR4百分率于第7天開始顯著下降（P＜0.01或P＜0.05）。不同時相點各組大鼠血漿中TLR4百分率變化見表6。

表6 不同時相點各組大鼠血漿中TLR4百分率變化（±s，n＝10）Tab6 Percentage of TLR4 in rat plasma at different time point（±s，n＝10）

表6 不同時相點各組大鼠血漿中TLR4百分率變化（±s，n＝10）Tab6 Percentage of TLR4 in rat plasma at different time point（±s，n＝10）

與模型對照組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.model control group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別模型對照組MEBO組不同時相點的TLR4百分率/%1 d 1.70±0.24 1.72±0.22 3 d 2.80±0.33 2.78±0.30 7 d 5.58±0.57 4.65±0.43＊14 d 7.58±0.69 6.08±0.53＊＊21 d 5.96±0.94 5.19±0.81＊28 d 3.68±0.35 3.30±0.38

4 討論

燒、燙傷后各種炎癥細胞因子包括TNF-α、IL-1、IL-6大量釋放，從而引發和加重全身炎癥反應[4，5]。近來研究發現，TLR4/LPS信號通路參與了燒傷后全身炎癥的發生[1]。

TLR家族是模式識別受體（Pattern recognition receptors，PRRs）中的一大類。TLR在人類進化過程中保持高度保守的分子適應性免疫，能識別細菌、真菌、病毒，還包括瘧原蟲等寄生蟲[6]。這種受體最早在果蠅體內發現，對果蠅的天然免疫起重要作用，后來在哺乳動物的體內陸續發現了這類Toll受體，它們參與、介導了LPS等相關分子模式誘發的先天免疫，目前已發現的TLR有13種（TLR1-13）[7]。

TLR4是第一個被鑒定的人類Toll樣受體，是機體識別細菌LPS的模式識別受體。TLR4與LPS相互作用的機制目前認為：LPS與單個核細胞膜上的脂多糖結合蛋白（LPS binding protein，LBP）結合；同時，Toll/IL-1受體家族胞漿區的接合蛋白——髓樣分化蛋白（Myeloid ifferentiation protein 88，MyD88）分子通過與TLR的相互作用形成復合物，再通過MyD88分子中的死亡結構域的同嗜作用募集IRAK（IL-1 receptor-associated kinase）與腫瘤壞死因子相關因子TRAT6（Tummor necrosis factor-associated factor 6）等信號途徑，激活核因子-κB（NF-κB），活化AP-1等轉錄因子，從而調節TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等細胞因子、黏附分子和炎癥因子的轉錄表達，進而影響免疫與炎癥反應[8]。

在與燒傷相關的研究中傅穎珺等[9]發現，嚴重燒傷時大鼠脾臟TLR4 mRNA和蛋白水平以及早期的致炎細胞因子水平均明顯升高；同時研究還發現，嚴重燒傷時TLR4的上調可能是通過調節性T細胞來實現的。在本研究中筆者同樣發現，燙傷后第14天開始大鼠TLR4的表達水平明顯升高，其結果與王明青等[10]的研究基本一致。而經過EMBO處理后，TLR4在燙傷大鼠外周血中的陽性表達率明顯下調。

MEBO作為一種有效的燒傷治療藥物，廣泛用于各種燒、燙、灼傷。本研究中，筆者以MEBO運用于燙傷大鼠，發現MEBO可有效縮短燙傷創面愈合時間并促進燙傷創面的愈合。筆者同樣觀察了燙傷大鼠血清中TLR4/LPS信號通路下游的效應分子TNF-α和IL-6的表達水平。結果發現，燙傷后第1天至第28天，模型對照組大鼠血清中TNF-α的水平逐漸降低，其結果與現有報道存在一定的差異。作為炎癥早期的致炎細胞因子，燙傷后TNF-α表達水平在24 h內迅速升高，隨后逐漸降低。而在本研究中，由于沒有設定燙傷后更早的時相點，故沒有觀察到TNF-α在燙傷后24 h內迅速上升的趨勢。IL-6作為炎癥中晚期出現上升趨勢的細胞因子，筆者觀察到燙傷后第3天IL-6升到最高峰，隨后緩慢下降。而經過MEBO處理后，與模型對照組比較，大鼠血清中TNF-α和IL-6的水平明顯降低，提示MEBO具有對TNF-α和IL-6的有效抑制效應。

在本研究中，筆者證實了MEBO對于燙傷創面愈合的促進作用，初步闡明了其作用機制可能與抑制TLR4/LPS信號通路及下游的致炎細胞因子TNF-α和IL-6的表達有關。但是，MEBO是如何調控TLR4/LPS信號通路中的調節分子從而促進燙傷創面愈合的，需要進一步研究。

[1]Thomas JA，Tsen MF，White DJ，et al.TLR4 inactivation and rBPI（21）block burn-induced myocardial contractile dysfunction[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2002，283（4）：H1 645.

[2]Wang HM，Cao WF，Peng YZ，et al.Changes in plasma levels of LPS，TNFalpha and IL-6 in burn patients with severe infection treated with imipenem or cefoperazone[J].Zhonghua Shao Shang Za Zhi，2004，20（2）：95.

[3]Kelly JL，O'Sullivan C，O'Riordain M，et al.Is circulating endotoxin the trigger for the systemic inflammatory response syndrome seen after injury?[J].Ann Surg，1997，225（5）：530.

[4]Myrianthefs PM，Baltopoulos GJ.Circulating cytokines and outcome prediction of burned children with concomitant inhalation injury[J].Crit Care，2008，12（3）：155.

[5]Finnerty CC，Herndon DN，Przkora R，et al.Cytokine expression profile over time in severely burned pediatric patients[J].Shock，2006，26（1）：13.

[6]Akira S，Takeda K.Toll-like receptor signalling[J].Nat Rev Immunol，2004，4（7）：499.

[7]Hemmi H，Takeuchi O，Kawai T，et al.A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA[J].Nature，2000，408（6 813）：740.

[8]Ahmad-Nejad P，H?cker H，Rutz M，et al.Bacterial CpGDNA and lipopolysaccharides activate Toll-like receptors at distinct cellular compartments[J].Eur J Immunol，2002，32（7）：1 958.

[9]傅穎珺，謝 勇，石俊強，等.嚴重燒傷早期大鼠脾臟Toll樣受體4的表達及意義[J].第二軍醫大學學報，2007，28（4）：412.

[10]王明青，孫元華，李學川，等.深Ⅱ度燒傷創面早期磨痂后大鼠血中LPS、TNF-α及IL-6的變化[J].山東大學學報（醫學版），2003，41（4）：427.