頭風寧滴丸中菊花的精制工藝研究Δ

朱怡潔，何偉，伍振峰（1.廣東藥學院藥物研究所/廣東省藥物新劑型重點實驗室，廣州市510006；.江西中醫學院現代中藥制劑教育部重點實驗室，南昌市 330004）

頭風寧滴丸處方由菊花、川芎、白芷等藥味組成，具有平肝活血、通絡止痛之功效，用于治療偏頭痛肝風挾瘀證。菊花為方中君藥，取其藥性升浮、輕清、清香之氣，升發清陽直達顛頂，使濁氣自降而頭痛自解[1]。原方以煎劑為用，后根據臨床用藥的特點和藥物理化性質、藥理作用，研制成滴丸，由于滴丸載藥量較小，須對處方藥物進行提取純化后方能成型。菊花中主要成分為綠原酸、黃酮類和揮發油等化合物[2]。本試驗以綠原酸比吸附量、洗脫率為評價指標，采用大孔吸附樹脂對菊花提取液進行精制，考察了樹脂種類、上樣量、上樣濃度、洗脫溶劑種類與用量等精制工藝參數。

1 儀器與試藥

ultimate 3000高效液相色譜（HPLC）儀（美國Dionex公司）；AB-8、X-5、NKA-9型大孔樹脂（天津南開大學化工廠）；HPD100、HPD400、HPD600、HPD200A、D101型大孔樹脂（滄州寶恩吸附材料科技有限公司）。

菊花購自廣州致信藥業有限公司，經廣東藥學院生藥學教研室劉基柱副教授鑒定為菊科植物菊ChrysanthemummorifaliumRamat.的干燥頭狀花序；綠原酸對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：0753-200111）；甲醇、乙腈為色譜純，水為屈臣氏蒸餾水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 綠原酸含量測定

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取綠原酸對照品0.010 06 g，置10 mL量瓶中，加乙醇溶解并定容，作為對照品貯備液。吸取對照品貯備液1 mL，置10 mL量瓶中，加乙醇溶解并定容，制成每1 mL含綠原酸0.100 6 mg的溶液，作為對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密吸取樣品溶液20 mL，水浴蒸干，殘渣加50%乙醇使溶解，并定容至10 mL量瓶中，作為供試品溶液。

2.1.3 色譜條件色譜柱：DIONEXAcclaim 120 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.4%磷酸溶液（12∶88）；檢測波長：328 nm；流速：1.0 mL·min-1。在此條件下，供試品中綠原酸與其他組分峰能達到基線分離，保留時間為8.3 min。

2.1.4 標準曲線的制備 分別精密吸取對照品溶液1、3、5、10、15、20 μL，注入液相色譜儀中，測定綠原酸色譜峰面積。以綠原酸峰面積積分值（Y）為縱坐標，進樣量（X）為橫坐標，進行線性回歸，得回歸方程為Y＝46.282 7X+0.892 8（r＝0.999 9）。結果表明，綠原酸進樣量在0.100 6～2.012 μg范圍內與峰面積積分值呈良好線性關系。

2.1.5 含量測定 分別吸取對照品溶液、供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀中，照“2.1.3”項下色譜條件測定綠原酸色譜峰面積，計算綠原酸含量。

2.2 大孔吸附樹脂精制工藝考察

2.2.1 樣品溶液的制備 取菊花藥材150 g，加8倍量水回流提取3次，每次1 h，合并提取液，濾過，減壓回收，離心處理（5 000 r·min-1）20 min，定容至1 000 mL，作為樣品溶液（每1 g生藥含綠原酸2.244 mg）。

2.2.2 樹脂種類的篩選 以綠原酸比吸附量、洗脫率為指標，對HPD100、HPD200A、HPD400、D101、X-5、HPD600、NKA-9、AB-8型大孔吸附樹脂進行選擇。

分別量取處理后的各型大孔吸附樹脂各10 mL，濕法裝柱（內徑1 cm，長10 cm，下述裝柱條件均與此相同），水洗至無醇味。取樣品溶液200 mL上柱，使其超載，用水90 mL洗至流出液近無色，流出液定容至100 mL，作為樣品溶液Ⅰ。再用70%乙醇90 mL洗脫，洗脫液定容至100 mL，作為樣品溶液Ⅱ。分別吸取樣品溶液Ⅰ、Ⅱ，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，照“2.1.5”項下方法測定綠原酸含量，按下式計算綠原酸比吸附量、洗脫率：比吸附量＝（上柱前藥液中總量－吸附殘液中含量）（mg）/樹脂體積（mL）；洗脫率＝醇洗脫液中含量/（上柱前藥液中總量－吸附殘液中含量）×100%。結果，HPD600型大孔吸附樹脂比吸附量為2.86 mg/mL樹脂，洗脫率為90.5%，均高于其他樹脂，故選擇HPD600型大孔吸附樹脂。樹脂優選比吸附量、洗脫率結果見表1。

表1 樹脂優選比吸附量、洗脫率結果Tab1 Adsorption quantity and elution rate of chlorogenic acid with different macroporous adsorption resin

2.2.3 大孔吸附樹脂吸附條件考察 （1）泄露曲線考察：精密量取樣品溶液100 mL，通過大孔吸附樹脂柱，水洗至近無色，分段收集流出液，每次10 mL，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液Ⅰ～Ⅹ，照“2.1.5”項下方法測定綠原酸色譜峰面積，計算綠原酸含量，以供試品編號為橫坐標，綠原酸質量（mg）為縱坐標，繪制泄漏曲線（見圖1）。結果顯示，當通過樹脂柱的樣品溶液達80 mL時，大孔吸附樹脂對綠原酸的吸附基本達到飽和。為使綠原酸保留完全，以80 mL作為最大上樣量，即為1.2 g（生藥）/mL樹脂。（2）樣品溶液濃度考察：精密量取樣品溶液適量，分別調節其濃度以菊花藥材計0.15、0.075、0.037 5 g·mL-1，各精密量取100、200、400 mL通過大孔吸附樹脂柱，水洗至流出液近無色，收集流出液，定容，作為樣品溶液Ⅰ-1、Ⅰ-2、Ⅰ-3；繼以70%乙醇100 mL洗至洗脫液近無色，收集洗脫液，定容，作為樣品溶液Ⅱ-1、Ⅱ-2、Ⅱ-3。分別取上述樣品溶液，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，照“2.1.5”項下方法測定綠原酸色譜峰面積，計算綠原酸含量、比吸附量和洗脫率。結果，上樣濃度為0.075 mg·mL-1時，比吸附量和洗脫率最高。樣品溶液濃度考察結果見表2。

圖1 綠原酸泄漏曲線Fig1 Leaking curve of chlorogenic acid

表2 樣品溶液濃度考察結果Tab2 The investigation result of the concentration of physic liquor

2.2.4 大孔吸附樹脂洗脫條件考察 （1）洗脫劑濃度選擇：精密量取0.075 mg·mL-1樣品溶液80 mL通過樹脂柱，水洗至近無色，分別以2倍柱體積的30%、50%、70%、90%乙醇洗脫同一樹脂柱，收集洗脫液，每20 mL為1份，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，照“2.1.5”項下方法測定綠原酸色譜峰面積，計算綠原酸含量。結果，70%乙醇洗脫效果較佳，可洗脫99%以上的綠原酸，故確定以70%乙醇為洗脫劑。（2）洗脫劑用量考察：按上述優選條件，精密量取樣品溶液通過樹脂柱，水洗至近無色，用70%乙醇洗脫，洗脫液以20 mL為單位收集，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，照“2.1.5”項下方法測定測定綠原酸含量。結果，4倍樹脂體積的洗脫劑洗脫率可達97%以上，故洗脫劑用量確定為4倍樹脂體積。

經以上試驗確定，大孔樹脂精制工藝條件為菊花提取液離心預處理（5 000 r·min-1）20 min后的藥液作為樣品溶液，調節樣品溶液濃度為0.075 g·mL-1（以菊花藥材計），最大上樣量為1.2 g（生藥）/mL樹脂，通過HPD600型大孔吸附樹脂，水洗至流出液近無色，繼以70%乙醇4倍樹脂體積洗脫，收集洗脫液。

以優選工藝條件進行中試放大試驗，大孔吸附樹脂精制后10批樣品中綠原酸的平均洗脫率為86.85%，證實所選工藝合理可行。

3 討論

由于提取液中所含雜質會阻塞大孔吸附樹脂，降低其吸附作用，故在過柱前要進行藥液的預處理。筆者考察了濾過法、離心法（5 000 r·min-1，20 min）和醇沉法（ρ＝1.05，醇濃度50%），結果顯示，離心法綠原酸損失最小，藥液澄明度好，故選擇離心法進行藥液預處理。

試驗中還考察了藥液pH值和鹽濃度對綠原酸比吸附量和洗脫率的影響。結果顯示，在一定pH范圍內，不同pH樣品溶液的比吸附量、洗脫率沒有明顯差異；其比吸附量、洗脫率隨鹽濃度的增加而減少，故選擇原液上樣。

大孔吸附樹脂純化效果受樹脂結構、吸附或洗脫條件及被分離物質結構等因素的影響，樹脂純化中可能發生活性成分的質與量的變化。因此，筆者分析比較了大孔吸附樹脂純化前后提取物的HPLC圖譜，并通過分析各組分峰的紫外吸收曲線考察純化效果。結果顯示，樹脂純化前后圖譜中相關活性成分峰的紫外吸收行為一致。

綜上所述，優選工藝似能較好地純化富集綠原酸，達到“去粗存精”的純化效果。

[1]吳凡偉，葉春燕.加味散偏湯聯合酚咖片治療偏頭痛30例[J].吉林中醫藥，2010，30（6）：495.

[2]于紅宇，李艷卿，陳歷雄.杭白菊藥液大孔樹脂精制工藝研究[J].中藥材，2009，32（7）：1 125.