茵連痛風(fēng)顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

李新液，徐玲玲，徐 熠，年 華（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥劑科，上海市 200437）

茵連痛風(fēng)顆粒為上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院的自制復(fù)方制劑，由茵陳、連錢草、伸筋草組成，具有清熱、利濕、通絡(luò)的功效。用于治療慢性痛風(fēng)、關(guān)節(jié)炎，幾十年的臨床應(yīng)用顯示，療效顯著。處方中所含綠原酸、阿魏酸等成分對慢性關(guān)節(jié)炎具有一定的治療效果[1]。為了有效控制該制劑的品質(zhì)，有必要對茵連痛風(fēng)顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行進(jìn)一步的研究探討。故本試驗(yàn)采用薄層色譜（TLC）法對組成藥物進(jìn)行定性鑒別；采用紫外分光光度法對處方中的主要成分總香豆素和總黃酮的含量進(jìn)行測定，以期能有效控制制劑質(zhì)量。

1 儀器與試藥

UV-2450紫外-可見分光光度計(jì)（日本島津公司）；80-1離心機(jī)（上海手術(shù)器械廠）；BransonB5200S-DT超聲提取器（必能信超聲（上海）有限公司）；HHS電熱數(shù)字顯示恒溫水浴鍋（上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司）。

蘆丁、阿魏酸、濱蒿內(nèi)酯對照品和連線草、茵陳對照藥材（中國藥品生物制品檢定所，批號分別為0080-9705、0773-9910、1511-200001、121109-200401、950-200204）；茵陳、連錢草、伸筋草藥材均購自上海康橋中藥飲片有限公司，由上海中藥質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)室葉愈青副主任藥師鑒定為真品；茵連痛風(fēng)顆粒（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥劑科制 劑 室 ，批 號 ：081001、081101、090722、090901、091001、091101、100401、100501、100601）；三氯化鋁、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、甲醇、乙醇等試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

2.1.1 茵陳的TLC鑒別 取茵連痛風(fēng)顆粒10 g，研細(xì)，加乙醇20 mL，水浴加熱回流30 min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，用醋酸乙酯振搖萃取2次，每次20 mL，合并醋酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，作為供試品溶液；將除茵陳外的所有藥材按處方比例制成陰性樣品，同法制成陰性對照溶液；另取茵陳對照藥材5 g，加水50 mL，煎煮1 h，放冷，濾過，濾液用醋酸乙酯振搖萃取2次，每次20 mL，合并醋酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，作為對照藥材溶液。照TLC法[2]試驗(yàn)，吸取上述溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一聚酰胺薄膜上，以醋酸為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)；陰性對照無干擾。茵陳的TLC見圖1。

2.1.2 連錢草的TLC鑒別 取本品粉末5 g，加70%甲醇50 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)檬兔眩?0～60℃）5 mL浸漬3 min，棄去石油醚，揮干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液；另取不含連錢草的各處方藥材，按組方比例制成陰性樣品，同法制成陰性對照溶液；另取連錢草對照藥材2.5 g，同法制成對照藥材溶液。照TLC法[2]試驗(yàn)，吸取上述溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲酸（8∶9∶0.5）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以3%三氯化鋁乙醇溶液，于105℃加熱數(shù)分鐘，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)；陰性對照無干擾。連錢草的TLC見圖2。

圖1 茵陳的TLC1.茵陳對照藥材；2～4.供試品（批號：100401、100501、100601）；5.缺茵陳陰性樣品Fig1 TLC of Artemisiae Scopariae Herba1.Artemisiae Scopariae Herba reference substance；2～4.test samples （batch number： 100401，100501，100601）；5.negative sample without Artemisiae Scopariae Herba

圖2 連錢草的TLC1.連錢草對照藥材；2～4.供試品（批號：100401、100501、100601）；5.缺連錢草陰性樣品Fig2 TLC of Glechoma longituba1.Glechomae Herba reference substance；2～4.test samples（batch number：100401，100501，100601）；5.negative sample without G.longituba

2.1.3 伸筋草的TLC鑒別 取茵連痛風(fēng)顆粒3 g，加10 mL蒸餾水使溶解，用醋酸乙酯-甲酸（9.5∶0.5）振搖提取2次，每次20 mL，合并提取液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液；另取缺伸筋草的所有藥材按處方比例制成陰性樣品，同法制成陰性對照溶液；另取阿魏酸對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的對照品溶液。照TLC法[2]試驗(yàn)，吸取上述溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以苯-醋酸乙酯-甲酸（8∶2∶0.2）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)；陰性對照無干擾。伸筋草的TLC見圖3。

2.2 總香豆素的含量測定

2.2.1 供試品溶液的制備 精密稱取茵連痛風(fēng)顆粒2.5 g，加70%乙醇15 mL，回流提取0.5 h，濾過，靜置2 h，取上清液1 mL，稀釋125倍，精密量取5 mL，置25 mL量瓶中，加70%乙醇至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥24 h的濱蒿內(nèi)酯對照品適量，加70%乙醇制成每1 mL含0.067 mg的溶液，作為對照品溶液。

2.2.3 測定波長的考察 取濱蒿內(nèi)酯對照品溶液、供試品溶液各適量，于200～600 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果對照品和供試品溶液均在345 nm波長左右有最大吸收，且相互無干擾，故選用345 nm作為檢測波長。紫外吸收光譜見圖4。

圖3 伸筋草的TLC1.阿魏酸對照品；2～4.供試品（批號：100401、100501、100601）；5.缺伸筋草陰性樣品Fig3 TLC of Lycopodium japonicum1.ferulic acid control；2～4.test samples（batch number：100401，100501，100601）；5.negative sample without L.japonicum

2.2.4 線性關(guān)系考察 分別精密量取對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，置25 mL容量瓶中，加70%乙醇至刻度，搖勻。以70%乙醇作為空白對照。以濱蒿內(nèi)酯檢測濃度（X）為橫坐標(biāo)，吸光度（Y）為縱坐標(biāo)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y＝0.058X－0.002（r＝0.999 9，n＝6）。結(jié)果表明，濱蒿內(nèi)酯檢測濃度在2.68～21.44 μg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液適量，分別于0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 h測定吸光度。結(jié)果，RSD＝1.14%（n＝6），表明在4 h內(nèi)供試品溶液較穩(wěn)定。

2.2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一對照品溶液，在345 nm波長處重復(fù)測定6次。結(jié)果，RSD＝0.24%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批茵連痛風(fēng)顆粒適量，研細(xì)，取6份，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別在345 nm波長處測定吸光度。結(jié)果，RSD＝1.61%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的樣品適量，共9份，精密稱定，各精密加入樣品含量80%、100%、120%的濱蒿內(nèi)酯對照品，按供試品溶液的制備方法制備，分別測定吸光度，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

圖4 紫外吸收光譜（Ⅰ）1.濱蒿內(nèi)酯對照品；2.茵連痛風(fēng)顆粒Fig4 UV absorbance spectrum（Ⅰ）1.escoparone control；2.Yinlian tongfeng granules

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 1Results of recovery test（n＝9）

2.2.9 樣品含量測定 取5批茵連痛風(fēng)顆粒適量，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別在345 nm波長處測定吸光度，計(jì)算總香豆素含量，結(jié)果見表2。

2.3 總黃酮的含量測定

2.3.1 供試品溶液的制備 精密稱取茵連痛風(fēng)顆粒1 g，置三角燒瓶中，加20 mL水溶解，加入95%乙醇34 mL，靜置2 h，離心，取上清液，即得。

2.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取120℃干燥至恒重的蘆丁對照品10.40 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇15 mL，超聲20 min使其溶解，放冷，加甲醇至刻度，即得。

表2 總香豆素的含量測定結(jié)果（n＝3）Tab2 Results of content determination of total coumarin（n＝3）

2.3.3 測定波長的考察 取蘆丁對照品溶液、供試品溶液各適量，于200～600 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。結(jié)果，對照品和供試品溶液均在513 nm波長左右有最大吸收，且相互無干擾，故選用513 nm作為檢測波長。紫外吸收光譜見圖5。

2.3.4 線性關(guān)系考察 分別精密量取對照品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，置20 mL容量瓶中，分別加 6.0、5.0、4.0、3.0、2.0、1.0、0 mL蒸餾水，再各加入5%亞硝酸鈉溶液1 mL，放置6 min后加三氯化鋁試液1 mL，放 置 6 min，再 加10%氫氧化鈉溶液10 mL，定容，放置15 min，以第一管作為空白組，在513 nm波長處測定吸光度。以蘆丁檢測濃度（X）為橫坐標(biāo)，吸光度（Y）為縱坐標(biāo)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y＝0.008 791X+0.005 8（r＝0.999 3）。結(jié)果表明，蘆丁檢測濃度在10～60 μg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取供試品溶液適量，按“2.3.4”項(xiàng)下方法，顯色15 min后每隔5 min測定其吸光度。結(jié)果，RSD＝0.47%（n＝8），表明顯色后在45 min內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取對照品溶液4.0 mL，按“2.3.4”項(xiàng)下方法操作并重復(fù)測定5次。結(jié)果，平均吸光度為0.361，RSD＝0.58%（n＝5），表明儀器精密度良好。

2.3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密量取同一批次茵連痛風(fēng)顆粒適量，共6份，按“2.3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照“2.3.4”項(xiàng)下方法操作并測定吸光度。結(jié)果，RSD＝0.38%（n＝6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.8 加樣回收率試驗(yàn) 稱取已知含量的茵連痛風(fēng)顆粒樣品適量，精密稱定，按“2.3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，各取9份供試品溶液1 mL，置20 mL容量瓶中，分別加入高、中、低濃度的蘆丁對照品溶液各3份，照“2.3.4”項(xiàng)下方法測定吸光度，并測定加樣回收率，結(jié)果見表3。

2.3.9 樣品含量測定 精密稱取不同批次的茵連痛風(fēng)顆粒適量，共5份，精密稱定，按“2.3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照“2.3.4”項(xiàng)下方法測定吸光度，計(jì)算總黃酮含量，結(jié)果見表4。

圖5 紫外吸收光譜（Ⅱ）1.蘆丁對照品；2.茵連痛風(fēng)顆粒（顯色）；3.茵連痛風(fēng)顆粒（未顯色）Fig5 UV absorbance spectrum（Ⅱ）1.rutin control；2.Yinlian tongfeng granules（coloration）；3.Yinlian tongfeng granules（non-coloration）

表3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab3 Results of recovery tests（n＝9）

表4 總黃酮含量測定結(jié)果（n＝3）Tab4 Results of content determination of total flavonoids（n＝3）

3 討論

本試驗(yàn)采用專屬性較強(qiáng)的TLC法對處方各藥味進(jìn)行定性鑒別，采用紫外分光光度法對主要成分進(jìn)行含量測定，可以有效地保證該制劑用藥的有效性及可靠性。

方中總香豆素具有一定的利尿抗炎[3]、抗氧化[4]的作用；黃酮類成分具有抗菌、抗炎、抗肝臟毒性、降壓等生物活性[5，6]。故對其進(jìn)行含量測定，可以快速、簡便、有效地對痛風(fēng)顆粒中的抗炎成分進(jìn)行質(zhì)量控制，從而保證制劑療效，達(dá)到質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

在總香豆素含量測定試驗(yàn)中，分別考察了30%、50%、70%和95%乙醇含量對試驗(yàn)的影響。結(jié)果顯示，70%乙醇的提取效果較優(yōu)。再對提取時(shí)間進(jìn)行考察，結(jié)果顯示，0.5 h的回流時(shí)間提取的總香豆素含量較高。

在總黃酮含量測定試驗(yàn)中，曾對顯色劑中的氫氧化鈉加入量進(jìn)行考察。結(jié)果表明，加入10 mL氫氧化鈉溶液進(jìn)行顯色的效果較好，且在45 min內(nèi)具有良好的顯色效果。茵連痛風(fēng)顆粒不同批次間的最高和最低含量相差倍數(shù)為2.07倍，故建議在控制制劑質(zhì)量時(shí)，測定其投料總黃酮含量。

[1]徐 熠，徐玲玲.中醫(yī)藥治療痛風(fēng)的研究進(jìn)展[J].中國藥房，2010，21（23）：2 195.

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