RP-HPLC法測定人血清中多索茶堿的濃度

王淑梅，張志清，楊秀嶺，王楠，張君（.河北醫科大學第二醫院，石家莊市050000；.河北醫科大學藥學院，石家莊市 05007）

多索茶堿（Doxofylline）為新型的非腺苷阻滯性支氣管擴張藥，具有平喘、抗炎和鎮咳作用。其療效較茶堿強，耐受性好，且不良反應較茶堿少，在治療支氣管痙攣方面可能成為茶堿替代品[1]。文獻[2]報道，多索茶堿對血管有獨特的耐受性，對中樞神經和胃腸道等無影響；對患有嚴重肝功能損害或伴隨喹諾酮類藥物治療的患者應進行血藥濃度監測。反相高效液相色譜（RP-HPLC）法測定多索茶堿血藥濃度已有文獻報道[3，4]，樣品處理方法主要有沉淀蛋白法和提取法。本試驗采用RPHPLC法對人血清中多索茶堿的濃度進行測定，并探索和改進方法，現報道如下。

1 材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀，包括515泵、486檢測器、Rheodyne 7725i進樣閥、Empower Pro工作站（美國Waters公司）；GL-20G-Ⅱ離心機（上海安亭科學儀器廠）；GL-88B渦旋混合器（江蘇海門麒麟醫用儀器廠）；CPA225D電子天平（德國Sartorius公司）。

1.2 試藥

多索茶堿對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：100625-200301）；內標：咖啡因對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：171215-200608）；甲醇為色譜純，異丙醇和三氯甲烷為分析純。空白血清由健康受試者提供。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（30∶70）；流速：1.0 mL·min－1；檢測波長：272 nm；進樣量：20 μL；柱溫：30 ℃。

2.2 溶液的制備

2.2.1 多索茶堿對照品貯備液：準確稱取多索茶堿對照品50.80 mg，置于50 mL容量瓶中，加甲醇溶液溶解、定容，得質量濃度為1 016 μg·mL－1的多索茶堿對照品貯備液，于4℃冰箱中保存備用。

2.2.2 內標溶液：準確稱取咖啡因對照品51.20 mg，置于50 mL容量瓶中，加甲醇溶液溶解、定容，精密吸取1.5 mL該溶液置于50 mL容量瓶中，以甲醇定容，得質量濃度為30.72 μg·mL－1的內標溶液，于4℃冰箱中保存備用。

2.3 血清樣品的處理

取血清樣品0.4 mL，加入內標溶液10 μL，再加入異丙醇-三氯甲烷（1∶4）5 mL，渦旋混合1 min，4 000 r·min－1離心10 min，取下清液4 mL置于離心管中，50℃恒溫水浴中氮氣吹干，殘渣加流動相100 μL溶解，取20 μL進樣。

2.4 方法專屬性

在“2.1”項色譜條件下，血清中內源性雜質對測定無干擾，多索茶堿與內標峰形良好，分離完全，其保留時間分別為9.5、6.4 min。高效液相色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.空白血清；B.空白血清+多索茶堿對照品+內標；1.多索茶堿；2.咖啡因Fig1 HPLC chromatogramsA.blank serum；B.blank serum+reference substance+internal substance；1.doxofyline；2.caffeine

2.5 標準曲線的制備

精密量取空白血清0.4 mL，加入多索茶堿系列對照品溶液及內標溶液各10 μL，搖勻，使多索茶堿濃度分別為0.101 6、0.254、0.508、1.016、2.302、4.064、8.128 μg·mL－1，按“2.3”項下方法操作，記錄色譜。以多索茶堿濃度（X）為橫坐標，多索茶堿與咖啡因峰面積之比（Y）為縱坐標進行線性回歸，得標準曲線方程為Y＝0.986 8X+0.022 8（r＝0.999 8）。結果表明，多索茶堿血藥濃度在0.1016～8.128 μg·mL－1范圍內線性關系良好。最低檢測濃度為0.011 μg·mL－1。

2.6 回收率試驗

2.6.1 提取回收率：分別配制低、中、高（0.254、1.016、4.064 μg·mL－1）3種濃度的血清對照品溶液各3份，按“2.3”項下方法操作并測定，以所得的色譜峰面積與相應濃度多索茶堿對照品溶液直接進樣獲得的色譜峰面積進行比較，考察樣品提取回收率。3種濃度下多索茶堿提取回收率分別為93.59%、95.52%和92.32%，RSD分別為5.55%、2.22%和3.75%。

2.6.2 方法回收率：分別配制低、中、高（0.254、1.016、4.064 μg·mL－1）3種濃度的血清樣品各3份，按“2.3”項下方法操作并測定，測得多索茶堿濃度，以實測濃度與加入濃度之比計算方法回收率，結果見表1。

2.7 精密度試驗

分別配制低、中、高（0.254、1.016、4.064 μg·mL－1）3種濃度的血清樣品各3份，按“2.3”項下方法操作，于同日內和5 d分別進樣分析，測定日內及日間精密度，結果見表1。

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表1 回收率及精密度試驗結果（±s，n＝3）Tab 1Results of recovery and precision test（±s，n＝3）

表1 回收率及精密度試驗結果（±s，n＝3）Tab 1Results of recovery and precision test（±s，n＝3）

加入濃度/μg·mL-1 RSD/%4.65 8.60 3.74測得濃度/μg·mL-1方法回收率/%RSD/%0.254 1.016 4.064 0.214 8±0.01 0.953 3±0.07 3.77 7±0.11 84.57 93.82 92.93 4.65 7.34 2.91日內精密度測得濃度/μg·mL-1 0.214 8±0.01 0.953 3±0.07 3.77 7±0.11 RSD/%4.65 7.34 2.91日間精密度測得濃度/μg·mL-1 0.214 7±0.01 0.929 6±0.08 4.011±0.15

2.8 樣品穩定性考察

配制中濃度（1.016 μg·mL－1）的血清樣品，按“2.3”項下方法操作，分別在0、2、4、8 h時測定，記錄色譜峰面積，計算多索茶堿含量。結果表明，處理后的血清樣品室溫下放置8 h內穩定，RSD＝1.13%（n＝3）。另配制中濃度的血清樣品，反復凍融（－20℃）3次后，按“2.3”項下方法操作。結果表明，樣品反復凍融3次后性質穩定，RSD＝1.60%（n＝3）。

3 討論

本試驗通過查閱文獻，優選出的色譜條件以甲醇-水（30∶70）為流動相，配比簡單，性質穩定，內源性雜質對測定無干擾。內標咖啡因在該色譜條件下，與多索茶堿完全分離，峰形和保留時間均較理想。樣品處理采用異丙醇-三氯甲烷（1∶4）進行提取，提取液簡便易得，可避免因沉淀蛋白不完全而造成的色譜柱堵塞。

試驗表明，本方法簡便、準確、靈敏度高、特異性好，可用于多索茶堿的血藥濃度測定及其臨床藥動學研究。

[1]顧 健，張春燕，曹兆龍，等.多索茶堿片在中國人的藥代動力學研究[J].中國新藥雜志，2000，9（6）：396.

[2]徐彥貴，卜一珊，何振梅，等.RP-HPLC法測定人血漿中多索茶堿濃度[J].中國藥師，2002，5（8）：467.

[3]張 波，劉 艷，杜智敏，等.反相高效液相色譜法測定血漿中多索茶堿的濃度[J].哈爾濱醫科大學學報，2004，38（1）：88.

[4]闞全程，李朵璐，師秀琴.HPLC測定慢性阻塞性肺疾病患者血清中多索茶堿濃度及其藥動學研究[J].藥物分析雜志，2009，29（5）：845.