帕金森病大鼠胃腸功能障礙和肌間神經叢一氧化氮變化的研究

趙 靜， 郭鋼花， 臧衛東， 張 華， 羅常月， 李倩倩

帕金森病(Parkinson disease，PD)是以黑質多巴胺能神經元丟失為特征的運動障礙疾病，同時伴有胃腸功能障礙等非運動癥狀，主要包括吞咽困難、胃排空障礙和便秘［1］。其機制尚不明確，可能與胃腸肌間神經叢一氧化氮變化有關。Greene等［2］研究顯示魚藤酮誘導的PD大鼠胃腸傳輸功能受損，但肌間神經叢NO能神經元沒有變化，Blandini等［3］研究顯示6-OHDA誘導的PD大鼠伴隨著結腸傳輸減慢，肌間神經叢NO能神經元是減少的，相反，Chaumette等［4］研究表明MPTP制作的靈長類PD模型肌間神經叢NO能神經元是增加的。為探討PD腸神經系統一氧化氮的變化，本研究利用6-羥基多巴胺(6-OHDA)損毀大鼠單側黑質多巴胺能神經元制作PD模型，觀察PD大鼠腸神經系統NO的改變對胃腸功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 雌性 SD大鼠60只，體重180～220g，鄭州大學實驗動物研究中心提供。隨機分為6-OHDA組和對照組，每組30只。

1.1.2 主要試劑與儀器 6-OHDA、阿樸嗎啡(APO)(美國Sigma公司);兔抗大鼠一氧化氮合酶(NOS)Ⅰ型多克隆抗體(北京博奧森生物技術有限公司);免疫組化SP試劑盒、DAB顯色試劑盒(北京中杉生物工程公司);逆轉錄(RT)試劑盒和聚合酶鏈(PCR)試劑盒(北京全式金生物技術有限公司);PCR引物由北京賽百盛生物技術有限公司合成。立體定位儀為江灣Ⅰ型;PCR GeneAmp System(2700)為美國Applied Biosystems公司產品;電泳儀(DYY-6C)為北京市六一儀器廠產品。

1.2 方法

1.2.1 大鼠 PD模型制作 10%水合氯醛(400mg/kg)腹腔注射麻醉，固定大鼠于立體定向儀上。以前囟為原點，參照包新民《大鼠腦立體定向圖譜》確定右側中腦黑質定位坐標(A:前囟后5.0mm，中線右側旁2.4mm，硬腦膜下7.6mm;B:前囟后5.6mm，中線右側旁開1.6mm，硬腦膜下 7.8mm)。鉆開顱骨，向6-OHDA組大鼠的每個坐標點注射6-OHDA 3μl(4μg/μl，溶于含質量濃度為 0.02%的維生素 C的生理鹽水中)，以 1μl/min注藥，留針10min，以1mm/min緩慢退針，隨后消毒、縫合皮膚。對照組用上述方法向每個坐標點注射含0.02%維生素C的生理鹽水3μl。術后3周，腹腔注射阿樸嗎啡0.5mg/kg誘導大鼠向左側旋轉，記錄30min內旋轉次數，大于210r/30min的大鼠為成功模型。

1.2.2 1h糞便排出量 造模后28d將每只大鼠單獨放在一個底部鋪有濾紙的干凈的籠子內。糞便排出后立即收集在一個密閉管中，稱重后得到糞便濕重。在65℃下干燥12h，再次稱重得到糞便干重。糞便含水量(%)=(糞便濕重-糞便干重)/糞便濕重×100%。

1.2.3 胃固體食物殘留率測定 造模后28d，兩組分別取10只大鼠禁食不禁水12h后，大鼠自由進食1h移去食物(進食前后分別稱重食物)。2h后麻醉處死大鼠，取出胃用濾紙拭干后稱全重，沿胃大彎剪開胃體，洗去胃內容物后用濾紙拭干，稱胃凈重，胃內殘留率(%)=(胃全重-胃凈重)/食物消耗量×100%。

1.2.4 胃腸nNOS免疫組化檢測 造模后28d每組取10只大鼠麻醉后經4%的多聚甲醛灌流固定，剖腹取大鼠胃竇和近端結腸組織(距盲腸3cm以下)，石蠟包埋，切片經脫蠟、梯度脫水后，3%H2O2室溫孵育15min，微波修復抗原，10%山羊血清封閉10min，傾去血清，加一抗(兔抗鼠NOSⅠ型多抗)，4℃孵育過夜，TBS洗3次，每次5min，加二抗37℃孵 30min，TBS洗 3次，每次 5min，DAB顯色。蘇木素復染，脫水、透明，中性膠封片，每組大鼠隨機選10張相應位置的切片。采用Biosens Digital Imaging System v1.6分析軟件計算胃竇和結腸nNOS免疫反應陽性區平均積分光密度。

1.2.5 胃竇及結腸平滑肌nNOS mRNA水平檢測 造模后28d各組取10只大鼠麻醉處死后立即剖腹，常規Trizol法提取胃竇和近端結腸組織總RNA，用RT試劑盒進行反轉錄獲取cDNA第一鏈片段。PCR擴增目的片段，nNO上游引物5’-CACATTTGCATGGGCTCG-3’，下游引物 5’-GACCTGAGATTCCCTTTGTT-3’;β-action 上 游 引 物 5’-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3’下 游 引 物 5’-CCCATACCACCATCACACC-3’。反應條件為:94℃預變性 2min，94℃變性 30s，50℃退火 30s，72℃延伸2min，30個循環，全部周期結束后于72℃延伸6min。2%瓊脂糖凝膠電泳，檢測目的條帶。用D-140圖像記錄分析系統對目的基因條帶的平均灰度值與相應的內參條帶的平均灰度值的比值進行比較。

2 結果

2.1 兩組大鼠1h糞便排出量的比較

見表1。與對照組比較，6-OHDA組大鼠1h糞便排出量及糞便含水量顯著低于對照組(P＜0.01)。

2.2 兩組大鼠胃固體食物殘留率的比較

見表1。與對照組比較，6-OHDA組大鼠胃內固體食物殘留率顯著高于對照組(P＜0.01)。

表1 兩組大鼠1h糞便濕重、干重、含水量和胃固體食物殘留率的比較(，n=10)

表1 兩組大鼠1h糞便濕重、干重、含水量和胃固體食物殘留率的比較(，n=10)

與對照組比較*P＜0.01

組別 糞便濕重(g) 糞便干重(g) 含水量(%) 胃殘留率(%)對照組6-OHDA組2.329 ±0.287 1.047 ±0.124*1.384 ±0.232 0.812 ±0.093*40.464 ±2.675 22.442 ±1.180*42.297 ±2.581 72.316 ±3.834*

2.3 兩組大鼠胃腸肌間神經叢nNOS表達的比較

nNOS陽性產物(主要是nNOS陽性神經元及神經纖維)為棕黃色。6-OHDA組大鼠胃竇部和近端結腸肌間神經叢nNOS陽性區平均積分光密度分別是87.56 ±7.50 和104.11 ±5.22，顯著低于對照組(132.02 ±11.91，142.82 ±6.32)，差別有統計學意義(P ＜0.01)(見圖1)。

圖1 6-0HDA組胃竇(B)及結腸(D)肌間神經叢nNOS表達明顯低于對照組(A、C)(免疫組化染色，×400)

2.4 兩組大鼠胃竇和結腸平滑肌nNOS mRNA水平的比較

應用RT-PCR方法得到的胃腸組織nNOS產物為386 bp，內參β-action為207 bp。6-OHDA組大鼠胃竇和近端結腸組織nNOS mRNA相對表達量為0.746±0.012 和 0.716 ±0.015，明顯低于對照組(1.563 ±0.031 和 1.489 ±0.030，均 P ＜0.01)(見圖2)。

圖2 胃竇和結腸nNOS mRNA水平表達的變化

3 討論

PD患者胃排空延遲主要表現為餐后胃脹氣、早飽、惡心等，Edwards等［1］研究表明24%的PD患者有惡心癥狀，45%有胃脹氣癥狀。Greene等［2］證明了魚藤酮誘導的PD大鼠有明顯的胃排空延遲;而1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)誘導的PD小鼠在不同的時間點胃固體食物的排空速度沒有改變［5］。本研究表明6-OHDA組大鼠胃排空速度明顯減慢，2h后胃內殘留率明顯大于對照組。

便秘是PD患者最常見的胃腸道癥狀。Jost等［6］發現所調查的PD患者中有80%結腸傳輸時間延長。Greene等［2］研究表明，魚藤酮誘導的PD大鼠存在暫時性的排便頻率減少;而MPTP處理的小鼠結腸運動功能亢進，排便頻率增加［5］。本研究表明6-OHDA組大鼠在造模后第4周糞便排出量和糞便含水量較對照組明顯減少。

PD是黑質紋狀體多巴胺含量減少，乙酰膽堿系統功能相對亢進引起的運動障礙疾病，多巴胺和乙酰膽堿也是腸神經系統重要的神經遞質。研究［2，4，5，7］表明 PD 患者和動物模型胃腸道膽堿能神經元數目沒有改變，多巴胺能神經元數目明顯減少。然而根據多巴胺抑制性的特點，胃腸道多巴胺能神經元的減少應該是加快而不是減慢胃排空。因此胃腸道非多巴胺能神經元在疾病進程中也可能受累。PD患者的腸肌叢，特別是NO能神經元發現存在asyn陽性包涵物，表明腸道NO能神經元受損可能與PD胃輕癱和便秘有關。Greene等［2］研究表明魚藤酮誘導的PD大鼠胃腸傳輸功能受損，但肌間神經叢NO能神經元沒有變化。Anderson等［5］研究表明腹腔注射神經毒素 MPTP制作的PD小鼠模型，遠端回腸NO能神經元沒有變化，Blandini等［3］通過腦立體定向注射神經毒素6-OHDA誘導的大鼠PD模型結腸傳輸減慢伴隨著肌間神經叢NO能神經元減少，也有研究［4］表明MPTP制作的靈長類PD模型肌間神經叢NO能神經元是增加的。本研究結果顯示，6-OHDA組大鼠有胃排空延遲和便秘，胃竇和近端結腸腸肌叢nNOS免疫陽性神經元顯著減少，nNOS mRNA水平顯著降低。這些研究結果的差異可能是由于不同的PD動物模型NO能系統內在不同造成的，或者是由于不同的給藥途徑、給藥劑量造成的。NO作為重要的抑制性神經遞質主要作用是使胃腸道平滑肌發生松弛反應，缺乏可導致胃竇舒張受損和結腸持續性痙攣性收縮，引起胃排空延遲和結腸傳輸減慢。因此臨床上PD患者出現的便秘和胃排空延遲可能是由于NO在胃腸道蠕動反射中介導的下行性抑制作用受損造成的。腸道NO能神經元受損可能會引起平滑肌過度收縮，導致肌肉痙攣引起結腸傳輸減慢，增加腸內容物水分的吸收［8］，因此6-OHDA組大鼠糞便含水量較對照組顯著減少。

本研究結果表明，6-OHDA誘導的PD大鼠存在胃排空延遲和便秘，可能與腸神經系統一氧化氮減少有關。目前，PD胃腸功能障礙還沒有有效的治療手段。研究PD腸神經系統神經遞質的變化、探討胃腸功能障礙的發生機制，可以早期進行更有效的藥物干預治療，提高患者的生活質量。

［1］Edwards LL，Pfeiffer RF，Quigley EMM，et al.Gastrointestinal symptoms in Parkinson’s disease［J］.Mov Disord，1991，6:151-156.

［2］Greene JG，Noorian AR，Srinivasan S.Delayed gastric emptying and enteric nervous system dysfunction in the rotenone model of Parkinson’s disease［J］.Exp Neurol，2009，218:154-161.

［3］Blandini F，Balestra B，Levandis G，et al.Functional and neurochemical changes of the gastrointestinal tract in a rodent model of Parkinson’s disease［J］.Neurosci Lett，2009，467:203-207.

［4］Chaumette T，Lebouvier T，Aubert P，et al.Neurochemical plasticity in the enteric nervous system of a primate animal model of experimental Parkinsonism［J］.Neurogastroenterol Motil，2009，21:215-222.

［5］Anderson G，Noorian AR，Taylor G，et al.Loss of enteric dopaminergic neurons and associated changes in colon motility in an MPTP mouse model of Parkinson’s disease［J］.Exp Neurol，2007，207:4-12.

［6］Jost WH，Schimrigk K.Constipation in Parkinson’s disease［J］.Klin Wochenschr，1991，69:906-909.

［7］Singaram C，Ashraf W，Gaumnitz EA，et al.Dopaminergic defect of enteric nervous system in Parkinson’s disease patients with chronic constipation［J］.Lancet，1995，346:861-864.

［8］Ueki A，Otsuka M.Life style risks of Parkinson’s disease:association between decreased water intake and constipation［J］.J Neurol，2004，251(7):18-23.