血小板膜糖蛋白CD41/CD61基因多態性及表達率與腦梗死的關系

李洪波， 朱辛明， 宋玉國， 熊 英， 王 萍

病理狀態下的血小板黏附、激活、聚集形成的動脈粥樣硬化被認為是腦梗死(cerebral infaretion，CI)的重要致病因素之一。活化狀態下的血小板膜糖蛋白CD41/CD61復合物能表達多種血小板受體功能，與纖維蛋白原、血管性血友病因子(vWF)、纖維連接蛋白、玻基結合素等粘連性蛋白結合形成異二聚體，在血小板聚集中起著關鍵作用。本實驗采用病例-對照的方法，研究血小板膜糖蛋白CD41/CD61的基因多態性及其表達率，探討血小板膜糖蛋白CD41/CD61與腦梗死的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

腦梗死組及對照組均來自吉林地區，漢族人。腦梗死組均為我院確診的腦梗死首發住院患者115例，其中男64例，女51例，年齡36～77歲，平均63±11歲。符合1995年全國第四次腦血管病學術會議制定的腦梗死診斷標準，均經頭顱CT或MR證實有相關責任病灶;排除既往腦出血、心肌梗死、冠心病、心臟瓣膜病、糖尿病等病史。對照組103例，均為同期門診健康體檢者，其中男59例，女44例，年齡33～79歲，平均61±10歲。

1.2 標本的采集

兩組均于清晨空腹抽取靜脈血2ml，所有受試者排除近3個月使用抑制血小板功能藥物史。

1.3 CD41/CD61基因多態性分析

1.3.1 DNA 的制備

采取的靜脈血標本EDTA-Na2抗凝，-40℃保存備用。根據《分子克隆實驗指南》(第3版)中蛋白酶K法提取全血標本DNA，提取試劑盒(離心柱型)購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3.2 聚合酶鏈反應(PCR)

1.3.2.1 CD41 PCR 擴增 CD41的上游引物5’-CTC AAG GTA AGA GCT GGG TGG AAG AAAGAC-3’，下游引物 5’-CTC ACT ACG AGA ACT GGA TCC TGA AGC CTC-3’。PCR反應總體積為10μl，含 200μmol/L dNTP，上、下游引物各 0.3μl和1μl DNA 模板，0.04μlTaqDNA 酶，反應條件為 95℃預變性7min，按下列程序循環，變性94℃30s，退火58℃30s，引物延伸 72℃15s，共 35 個循環，最后72℃延伸7 min。取2μl PCR產物在2%的瓊脂糖凝膠上電泳，全自動凝膠成像系統分析結果。

1.3.2.2 CD61 PCR 擴增 CD61的上游引物5’-CTG CAG GAG GTA GAG AGT CGC CAT AG-3’，下游引物5’-CTC TCT AGA CCT CCA CCT TGT GCT CT-3’，PCR 反應總體積為 10μl，含 200μmol/L dNTP，上、下游引物各 0.3μl和 1μl DNA 模板，0.04μl TaqDNA 酶，反應條件為 95℃ 預變性 7min，按下列程序循環，熱變性94℃30s，退火64℃30s，引物延伸72℃15s，共35個循環，最后72℃延伸7min。取2μl PCR產物在2%的瓊脂糖凝膠上電泳，全自動凝膠成像系統分析結果。

1.3.3 限制性內切酶酶切

取CD41 PCR擴增產物4μl用內切酶FokⅠ1μl酶切，CD61 PCR擴增產物用內切酶 ScrFⅠ1μl酶切，37℃水浴6h，反應結束后，各取酶切產物10μl，與1.5μl 6×Loading Buffer(DNA 上樣緩沖液)混合，應用含EB 的(終濃度1.0μg/ml)2.0%高分辨率瓊脂糖凝膠電泳，全自動凝膠成像系統分析結果。

1.4 CD41/CD61表達率檢測

采取的靜脈血標本6h之內進行檢測。使用美國Beckman Coulter公司的流式細胞儀，型號為Epics-XL，每個樣本分析 10000個血小板，結果以CD41/CD61陽性細胞的百分率表示。所用試劑均由美國Beckman Coulter公司生產。

1.5 統計學分析應用

應用SPSS 11.5統計學軟件進行數據處理，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CD41基因多態性分布分析

限制性內切酶FokⅠ將PCR產物切成3種形態:aa(切開型)，ab(部分切開型)，bb(未切開型)。腦梗死組的aa型少于對照組，bb型多于對照組，而兩組的ab型基本相等。腦梗死組bb基因型頻率為41.7%，對照組為23.3%，兩組比較有顯著性差異(P ＜0.05)(見表1)。

2.2 CD61基因多態性分析

酶切產物瓊脂糖凝膠電泳分析均顯示為基因型aa(未切開型)。腦梗死組 b等位基因頻率為60.4%，對照組為47.6%，兩組比較有顯著性差異(P ＜0.05)(見表2)。

2.3 兩組間CD41/CD61表達率比較

腦梗死組CD41/CD61表達率為96.0% ±8%，對照組為85.5% ±13%，有統計學意義(P＜0.05)(見表3)。

2.4 兩組間CD41基因多態性與CD41/CD61表達率比較

腦梗死組CD41 bb基因型CD41/CD61表達率較aa基因型增高明顯，差異有顯著性(P＜0.05)(見表4)。

表1 兩組間CD41基因型分布比較

表2 兩組間CD41等位基因比較

表3 兩組間CD41/CD61表達率比較

表4 兩組間CD41基因多態性與CD41/CD61表達率比較

3 討論

腦梗死是嚴重危害人類身體健康的疾病，動脈硬化是其病理學發病基礎，尤其是頸部大血管和腦內動脈存在的粥樣硬化斑塊破裂時，血管內膜損傷激活血小板，血管內皮組織和血液中的其他多種成分也同時被激活。在血小板的參與下，血小板和纖維蛋白原聚集成團，不可逆的形成動脈血栓，進而造成血管栓塞［1，2］。

CD41抗原為整合素的αⅡb鏈，CD61抗原為β2鏈，兩者共同形成CD41/CD61(GPⅡb/Ⅲa)復合物。現已證實，CD41/CD61復合物是一種雜二聚體整合素，其在胚胎發生、炎癥、免疫反應、腫瘤轉移及細胞聚集等各個方面起著關鍵作用。CD41/CD61的分子生物學研究表明基因定位于17q21～q22，位于血小板表面，每個血小板表面大約有5 000個CD41/CD61糖蛋白分子，眾多研究證實CD41/CD61與纖維蛋白原等的結合是血小板凝集過程中的最后共同途徑。國外有研究表明CD41基因多態性與腦梗死發生有關［3，4］。國內段淏等［5］采用病例對照分析方法，對上海地區221例入選者進行CD41基因多態性分析，結果也表明CD41基因多態性與腦梗死的發生有相關性。Wagner等［6］進行了 CD61基因多態性分析，研究表明，年輕女性缺血性腦卒中與CD61的PlA2多態性無明顯相關性;馬麗媛［7］、劉彥虹［8］等國內學者也進行了CD61基因多態性的相關研究，認為PlA基因多態性與腦血栓的發生無相關性，他們均認為CD61 PlA基因多態性可能不是中國人缺血性腦卒中重要的危險因素。本實驗采用病例對照組方法，應用PCR-RFLP技術檢測CD41/CD61基因多態性，結果表明CD41的b等位基因頻率腦梗死組較對照組明顯增高;CD61基因型兩組均為aa型(未切開型)。

近年來，隨著識別不同活化血小板膜抗原的單克隆抗體試劑的相繼上市，血栓關聯性疾病的血小板膜糖蛋白表達分析逐漸成為研究熱點，采用流式細胞術檢測血小板活化程度，具有快速、敏感、準確、特異等諸多優點。國外最先研究認為，血小板活化時CD41/CD61復合物作為纖維蛋白受體可出現變化，表達率增高［9］，也有人提出檢測相關表達率可作為血栓性疾病的預測指標之一［10］，國內相關研究也支持上述觀點［11］。我們采用流式細胞術技術，研究結果顯示腦梗死組CD41/CD61表達率較對照組增高，有統計學意義(P＜0.05)。同時，本實驗還將兩組組間按CD41基因型分組檢測CD41/CD61表達率，結果腦梗死組CD41 bb基因型CD41/CD61表達率較 aa基因型明顯增高，差異顯著 (P＜0.05)，研究結果表明 CD41 bb基因影響 CD41/CD61表達率。因此對腦梗死患者進行CD41基因多態性分析結合檢測血小板膜糖蛋白CD41/CD61表達率，可作為腦梗死的觀察指標之一。但是，腦梗死是多基因、多病因疾病，同時還受到個體差異等多種因素的影響，綜合研究多種基因多態性與表達率在腦梗死疾病發生發展中的相互影響及累積效應，顯然較個別基因多態性與表達率關系研究意義更大，這都有賴于今后進一步的研究和探索。

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