發酵液中替考拉寧含量的HPLC法測定

張波

替考拉寧(Teicoplanin)為新型糖肽類抗生素，抗菌譜及抗菌活性與萬古霉素相似，對金黃色葡萄球菌的作用比萬古霉素更強，不良反應更少。本品對革蘭陽性菌如葡萄球菌、鏈球菌、腸球菌和大多厭氧性革蘭陽性菌敏感，具有較強的殺菌活性。由于替考拉寧獨特的作用機制，很少出現耐替考拉寧的菌株，所以對青霉素類及頭孢菌素類，大環內酯類、四環素類和氯霉素類，氨基糖苷類和利福平耐藥的革蘭陽性菌，仍對替考拉寧敏感［1，2］。本文采用高效液相色譜法，乙腈-磷酸鹽體系作為流動相，對發酵液中的替考拉寧含量測定方法進行研究，結果滿意。

1 儀器與試劑

Waters1525型液相色譜儀(美國Waters公司)，UV100型紫外檢測器，替考拉寧對照品(中國藥品生物制品檢定所提供)，替考拉寧樣品(山東魯抗醫藥股份有限公司);乙腈(色譜純，天津四友公司)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為磷酸鹽緩沖液(pH=6.0)-乙腈(75∶25)，流速1.0 ml/min，檢測波長為 254 nm，進樣量 10 μl。

2.2 檢測波長的選擇 對替考拉寧對照品的流動相溶液進行紫外掃描，結果在254 nm附近有較大吸收，在此波長處發酵液無明顯干擾，故選擇254 nm作為檢測波長。

2.3 標準溶液的配制 精密稱取替考拉寧對照品約20 mg，置10 ml容量瓶中，振搖，用流動相溶解至刻度，作為供試品溶液，另取替考拉寧樣品適量，同法操作。

2.4 系統適用性試驗 取10 μl對照品溶液注入液相色譜儀，記錄色譜圖。在該色譜條件下，替考拉寧峰與其他雜質峰分離度大于1.2。

2.5 破壞性試驗 稱取替考拉寧對照品各約200 mg，分別置于3個100 ml容量瓶中，分別加入1 mol/L鹽酸、1 mol/L氫氧化鈉，3%的過氧化氫溶液各10 ml，于室溫放置1 h，用流動相定容，作為破壞后的供試品溶液，分別取10 μl注入液相色譜儀，結果替考拉寧與雜質分離良好。

2.6 線性關系 精密稱取替考拉寧對照品適量，分別制成每1 ml中含替考拉寧 500.0，1000.0，2000.0，3000.0，4000.0，5000.0 μg的溶液，注入液相色譜儀，以替考拉寧峰面積A為縱坐標，濃度C為橫坐標，計算得回歸方程為:

A=487939 C，r=0.9988

2.7 最低檢測限 采用逐級稀釋法，以S/N≥3為最低檢出限，測得最低檢測限為4.50ng。

2.8 精密度試驗 試驗按2.3項下配制的2000 μg/ml的溶液，連續進樣6次，計算其RSD為0.55%。

2.9 加樣回收率試驗 取已知含量的替考拉寧樣品，制成2.3項下濃度的替考拉寧供試品溶液，共6份，分別精密加入含已知量的對照品溶液，搖勻，取10 μl進樣，結果替考拉寧的平均回收率為100.2%(RSD=0.14%，n=6)。結果見表1

2.10 發酵液中樣品測定 取約20 ml發酵液用2 mol/L氫氧化鈉調 pH=11，攪拌10 min，在3000轉/min下離心10 min，取上清液，以2 mol/L鹽酸調pH至8.5，取調后上清液，過濾。取稀釋配制成約2000 μg/ml的溶液，搖勻，過濾，取10 μl進樣，結果在此色譜條件下，發酵液中雜質對主峰無干擾，分析重復性及精密度結果較滿意。

表1 加標回收率試驗結果

3 討論

本文采用乙腈-磷酸鹽體系作為流動相對替考拉寧進行樣品測定，精密度好，色譜峰對稱性也較好，同時我們還對樣品溶液經過不同時間的放置來檢驗樣品在溶液中的穩定性，發現樣品在本流動相溶液中相當穩定，適宜于成品的檢測和發酵液中間體的質量控制。

［1］夏振強，古勇，官家發.糖肽類抗生素替考拉寧研究進展.天然產物研究與開發，2005，18(2):236-238.

［2］何禮賢，潘玨，陳世耀，等.替考拉寧治療革蘭陽性球菌感染的臨床研究.中華內科雜志，2005，33(5):532-533.