宮頸癌組織中sFRP1和β-catenin的表達及其意義

張孝艷 喬玉環 王琳 郭瑞霞

鄭州大學第一附屬醫院婦產科，河南 鄭州 450052

宮頸癌是威脅女性健康的第二大婦科惡性腫瘤，并具有年輕化趨勢。現已證實人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染是宮頸癌及癌前病變的重要致病因素，大部分感染者可自然消退，僅有少數感染的婦女最終發展為宮頸癌［1］，這表明HPV感染并不是導致宮頸癌發生的唯一因素。近年來，Wnt信號通路在腫瘤形成過程中的作用成為研究的熱點。分泌型卷曲相關蛋白1(secreted frizzled related protein 1，sFRP1)是Wnt信號通路的負調控因子，對Wnt信號通路的傳導具有重要的抑制作用。β-連環蛋白(β-catenin)作為Wnt信號傳導途徑的核心元件參與調節該通路。本研究通過檢測sFRP1和β-catenin在宮頸癌組織、宮頸上皮內瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)及正常宮頸組織中的表達情況，探討其在宮頸癌發生、發展中的作用及與宮頸癌預后的關系。

1 資料和方法

1.1 研究對象

收集鄭州大學第一附屬醫院2001年—2005年病理科存檔的宮頸石蠟標本128例，其中正常宮頸20例，CIN 30例，宮頸癌78例(均有確切隨訪資料)。宮頸癌組織學類型：鱗癌60例，腺癌18例；臨床分期(FIGO，2000)：Ⅰ期34例，Ⅱ期31例，Ⅲ～Ⅳ期13例；病理學分級：G1～G254例，G324例；伴有淋巴結轉移者21例。患者中位年齡41歲(25～65歲)，術前均未接受放化療。所有標本均經病理學證實。

1.2 試劑和方法

兔抗人sFRP1抗體和兔抗人β-catenin抗體均購自北京雷根生物技術有限公司，免疫組化(SP法)試劑盒、二氨基聯苯胺(DAB)顯色劑及抗原修復液均由北京中杉金橋生物技術有限公司提供。操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行。用已知的sFRP1和β-catenin陽性切片作為陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3 結果判定

1.3.1 sFRP1的判定［2］

sFRP1陽性反應定位于細胞膜和細胞質，呈棕黃色顆粒。光學顯微鏡下選取5個視野(×400)，每個視野計數100個細胞。陽性細胞≤2%記為0分，>2%～<20%為1分，20%～<50%為2分，≥50%為3分。按著色深淺記分，無著色為0分，淺著色為1分，深著色為2分。上述兩項分值相加為著色強度積分值：<2分為陰性(-)，2～<3分為弱陽性(+)，3～<4分為陽性(++)，≥4分為強陽性(+++)。

1.3.2 β-catenin的判定［3］

β-catenin正常染色定位于細胞膜。光學顯微鏡下選取5個視野(×400)，每個視野計數100個細胞。陽性細胞<25%記為0分，25%～<50% 為1分，50%～<75% 為2分，≥75%為 3分。按染色強度：無染色0分，淡黃染色1分，深黃色2分，棕褐色3分。取兩者之和：0分為陰性(-)，1～2分為弱陽性(+)，3～4分為陽性(++)，5分及5分以上為強陽性(+++)。其中>10%細胞質和(或)細胞核出現β-catenin表達為異位表達，陰性(-)、弱陽性(+)和異位表達皆為異常表達，陽性(++)、強陽性(+++)為正常表達。

1.4 統計學處理

所有數據用SPSS 16.0軟件包進行處理。率的比較采用χ2檢驗，相關性檢驗采用Spearman等級相關分析，生存率采用Kaplan-Meier和logrank分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 sFRP1的表達及其與宮頸癌臨床病理特征的關系

20例正常宮頸 上皮組織sFRP1染色均呈陽性，陽性率為100.0%(圖1A)。30例CIN組織中sFRP1陽性率為70.0%(21/30)，呈弱表達(圖1B)。78例宮頸癌組織中sFRP1陽性率為33.3%(26/78)，呈微弱表達(圖1C、D)。3組比較差異有統計學意義(χ2=33.26，P<0.05)。

宮頸癌組織中臨床Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ～Ⅳ期sFRP1表達陽性率分別為50%、25.8%和7.7%，差異有統計學意義(χ2=8.89，P<0.05)，其中Ⅰ期的表達率明顯高于Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期(P<0.05)；有淋巴結轉移組顯著高于無淋巴結轉移組(66.7%vs 28.1%，P<0.05)；sFRP1的表達與宮頸癌的病理學分級和組織學類型均無關(P>0.05，表1)。

2.2 β-catenin的表達及其與宮頸癌臨床病理特征的關系

正常宮頸上皮β-catenin主要表達于細胞膜上，呈棕褐色細小顆粒狀，僅1例同時出現細胞質陽性著色，細胞核無著色。在CIN及宮頸癌組織中，β-catenin呈明顯的異常表達，表現為細胞膜表達減弱或消失，細胞質和(或)細胞核出現明顯的著色(圖2)。β-catenin在正常宮頸、CIN及宮頸癌組織中的異常表達率分別為5%(1/20)、43.3%(13/30)、70.5%(55/78)，差異有統計學意義(χ2=29.56，P<0.05)。

宮頸癌組織中臨床Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ～Ⅳ期β-catenin異常表達率分別為52.9%、80.6%和92.3%，差異有統計學意義(χ2=9.55，P<0.05)，其中Ⅰ期的異常表達率顯著低于Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期(P<0.05)；β-catenin異常表達強度在病理學分級G1～G2與G3之間的差異有統計學意義(P<0.05)；β-catenin異常表達強度在有淋巴結轉移和無淋巴結轉移的患者中，差異有統計學意義(P<0.05)；β-catenin異常表達與宮頸癌的組織學類型無關(P>0.05)。

圖1 sFRP1在各組織中的表達Fig.1 The expression of sFRP1 in different tissues(SP, ×400)

圖2 β-catenin在各組中的表達Fig.2 The expression of β-catenin in different tissues(SP, ×400)

表1 sFRP1與β-catenin的表達與宮頸癌臨床病理特征的關系Tab.1 The relationship between expressions of sFRP1 and β-catenin and clinicopathological characteristics in cervical cancer

2.3 宮頸癌組織中sFRP1表達與β-catenin表達的相關性

34.6%的sFRP1陽性表達宮頸癌患者中β-catenin呈現異常表達，而sFRP1陰性表達的宮頸癌患者中β-catenin的異常表達率達88.5%，差異有顯著的統計學意義(P<0.001)。宮頸癌組織中sFRP1陽性表達與β-catenin的異常表達呈負相關(r=-0.557，P<0.001)。

2.4 sFRP1、β-catenin表達與宮頸癌預后的關系

在78例宮頸癌患者中，sFRP1陽性表達26例，陰性表達52例，sFRP1陽性表達者5年生存率高于陰性表達者(79.8% vs 60.5%，P<0.05)。β-catenin正常表達23例，異常表達55例，正常表達者5年生存率顯著高于異常表達者(83.7%vs 59.2%，P<0.05)。

3 討 論

sFRP1在胚胎發育階段參與眼、腦及血管系統的形成和細胞分化，在成體中主要表達于腦脈絡膜、視網膜、晶狀體、睫狀體及血管內皮等組織，參與這些組織的代謝［4］。sFRP1作為W nt信號上游抑制因子，含有一個CRD(半胱氨酸富含域)結構域，其部分氨基端序列與Wnt蛋白受體即卷曲蛋白(frizzled，Frz)結構類似，通過與Frz競爭結合Wnt蛋白或與Frz結合成無功能的復合體發揮抑制Wnt信號通路的作用，在抗腫瘤及促細胞凋亡等生物過程中起到了一定的作用［5］。Chunga等［6］研究證實了sFRP1在宮頸癌細胞中是一種抑癌基因，sFRP1的表觀遺傳學沉默激活了Wnt經典通路的原癌基因，并且通過轉染技術使sFRP1重新表達后，能夠有效抑制宮頸癌CaSki細胞的增殖、轉移及侵襲。有研究表明，sFRP1在多種人類實體腫瘤中存在表達缺失，如結直腸癌、乳腺癌及腎細胞癌等［7-9］。

本研究結果發現，隨著病變程度的加深，sFRP1的表達呈下降趨勢，在正常宮頸上皮組織、CIN和宮頸癌組織中的陽性率分別為100.0%、70.0%和33.3%，差異具有統計學意義(P<0.05)，表明從癌前病變發展到浸潤癌的過程中sFRP1可能起了重要作用。宮頸癌臨床Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ～Ⅳ期sFRP1陽性表達率也呈現逐漸下降趨勢，分別為50.0%、25.8%和7.7%，其中Ⅰ期的陽性表達率明顯高于Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期(P均<0.05)，且有淋巴結轉移者顯著高于無淋巴結轉移者(P<0.05)，提示sFRP1的表達可能與宮頸癌細胞的侵襲及轉移有關。

β-catenin是連環蛋白家族中一員，具有介導細胞黏附及信號轉導的雙重功能。β-catenin在細胞質內以兩種形式存在：一種為結合型，與E-cadherin結合參與調節同種細胞間的黏附；一種為游離型，參與Wnt信號傳導途徑。游離的β-catenin可通過核膜進入到細胞核內，與轉錄因子Tcf/Lef結合，激活Wnt途徑靶基因，如c-myc、cyclin D1，調節細胞的增殖，參與腫瘤形成［10］。

Nakopoulou等［11］通過檢測141例乳腺癌標本中β-catenin的表達，結果發現細胞核內β-catenin高表達與乳腺癌的侵襲性及不良預后有關。Wanitsuwan等［12］對163例結直腸癌研究發現，β-catenin的細胞核異常表達率高達81.4%，并與腫瘤的臨床分期及淋巴結轉移有關。Sangkhathat等［13］通過在肝癌細胞內轉染siRNAs引起細胞內β-catenin表達下降，從而達到抑制肝癌細胞增生的作用。Chunga等［6］在宮頸癌CaSki細胞質及細胞核中發現有β-catenin的異常聚集。

本研究結果表明，從正常宮頸組織發展為CIN再演變為宮頸癌，β-catenin的異常表達逐漸增強，且宮頸癌組明顯高于其他兩組，提示β-catenin的異常積聚可能在宮頸上皮癌變過程中起重要作用。隨著Wnt信號通路拮抗劑sFRP1在宮頸癌組織中表達的逐漸減弱，β-catenin的異常表達程度呈逐漸增高趨勢。表明sFRP1的低表達可能是導致β-catenin正常表達下降、異常表達升高的因素之一，并且sFRP1與β-catenin的作用不是獨立的，而是共同作用促進宮頸癌的發生、發展、侵襲及轉移。

本研究結果還證實，sFRP1、β-catenin的表達與宮頸癌的預后有關，可作為預測宮頸癌預后的指標之一。

綜上所述，在宮頸癌組織中Wnt信號傳導通路抑制蛋白sFRP1呈明顯的表達減弱或缺失，β-catenin的細胞膜表達減弱，細胞質及細胞核的異常積聚增加，表明Wnt傳導通路在宮頸癌中處于激活狀態，提示該傳導通路與宮頸癌的發生、發展密切相關。信號抑制蛋白sFRP1的表達減弱可能是導致β-catenin在細胞質和細胞核內積聚以及Wnt信號活化的原因之一，并且sFRP1和β-catenin有望成為預測宮頸癌預后的指標及生物靶向治療的靶點。

［1］ FENDRI A, MASMOUDI A, KHABIR A, et al. Inactivation of RASSF1A, RAR beta 2 and DAP-kinase by promoter methylation correlates with lymph node metastasis in nasopharyngeal cancer［J］. Cancer Bio Ther, 2009, 8(5):444-451.

［2］ 蘇姍, 闞艷艷, 田永杰. sFRP-1、Wnt-1在宮頸癌及癌前病變中的表達及意義［J］. 山東大學學報(醫學版), 2010,48(1):97-101.

［3］ 柳華, 彭芝蘭. Wnt信號通路關鍵蛋白與上皮性卵巢癌間的關系［J］. 現代腫瘤醫學, 2010, 18(2): 377-379.

［4］ RATTNER A, HSIEH J C, SMALLWOOD P M, et al. A family of secreted proteins contains homology to the cysteine-rich ligand-binding domain of frizzled receptors［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 94(7): 2859-2863.

［5］ KAWANOY Y, KYPYA R. Secreted antagonists of the Wnt signalling pathway［J］. J Cell Sci, 2003, 116(13):2627-2634.

［6］ CHUNGA M T, LAIC H C, SYTWUA H K, et al. SFRP1 and SFRP2 suppress the transformation and invasion abilities of cervical cancer cells through Wnt signal pathway［J］.Gynecol Oncol, 2009, 112(3): 646-653.

［7］ VEECK J, NIEDERACHER D, AN H, et al. Aberrant methylation of the Wnt antagonist SFRP1 in breast cancer is associated with unfavourable prognosis［J］. Oncogene,2006, 25(24): 3479-3488.

［8］ QI J, ZHU Y Q, LUO J, et al. Hypermethylation and expression regulation of secreted frizzled-related protein genes in colorectal tumor［J］. World J Gastroenterology,2006, 12(44): 7113-7117.

［9］ DAHL E, WIESMANN F, WOENCKHAUS M, et al. Frequent loss of SFRP1 expression in multiple human solid tumours:association with aberrant promoter methylation in renal cell cancer［J］. Oncogene, 2007, 26(38): 5680-5691.

［10］ LOPEZ-KNOWLES E, ZARDAWI S J, et al. Cytoplasmic localization of beta-catenin is a marker of poor outcome in breast cancer patients［J］. Cancer Epi Bio Pre, 2010, 19(1):301-309.

［11］ NAKOPOU LOU L, MYLONA E, PAPADAKI I, et al. Study of phospho-beta-catenin subcellular distribution in invasive breast cancers in relation to their phenotype and the clinical outcome［J］. Mod Pathol, 2006, 19(4): 556-563.

［12］ WANITSUWAN W, KANNGURN S, BOONPIPATT ANAPONG T, et al. Overall expression of beta-catenin outperforms its nuclear accumulation in predicting outcomes of colorectal cancers［J］. World J Gastroenterol, 2008, 14(39):6052-6059.

［13］ SANGKHATHAT S, KUSAFUKA T, MIAO J Y, et al. In vitro RNA interference against beta-catenin inhibits the proliferation of pediatric hepatic tumors［J］. Int J Oncol,2006, 28(3):715-722.