利用稻草液體發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶及酶粉提取的研究＊

譚 宏，劉選明，盛培科，廖勝輝，黃小峰，何 迪

（湖南大學(xué) 生物學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410082）

纖維素酶是降解纖維素生成葡萄糖的一組酶的總稱[1－2].纖維素在地球上的有機(jī)質(zhì)中分布最廣，含量最豐富.湖南省的纖維素資源十分豐富，每年僅稻草就多達(dá)數(shù)千萬(wàn)噸.因此，纖維素的開(kāi)發(fā)利用與轉(zhuǎn)化對(duì)于解決工農(nóng)業(yè)原料來(lái)源、世界能源危機(jī)、環(huán)境污染等問(wèn)題具有重要意義.纖維素酶已廣泛應(yīng)用于飼料、醫(yī)藥、食品加工、生物能源、油井開(kāi)采、細(xì)胞生物工程和工業(yè)洗滌劑等行業(yè).

纖維素酶的工業(yè)化生產(chǎn)目前主要有固體發(fā)酵法和液體深層發(fā)酵法2種[3－4].固體法工藝簡(jiǎn)單，易污染，難控制.液體深層發(fā)酵技術(shù)水平先進(jìn)，難度大，僅有美國(guó)、日本等幾個(gè)國(guó)家掌握并用于生產(chǎn)，特點(diǎn)是發(fā)酵原料利用率高，生產(chǎn)條件易控制，是當(dāng)今世界纖維素酶生產(chǎn)的主攻方向.纖維素酶的提取方法有鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法等[5].鹽析法的根據(jù)是蛋白質(zhì)在稀鹽溶液中，隨鹽濃度增高到一定數(shù)值時(shí)，蛋白質(zhì)表面電荷被中和，引起蛋白質(zhì)分子間互相凝聚并從溶液中析出[6].有機(jī)溶劑沉淀法是用與水可混溶的有機(jī)溶劑，如乙醇等，使蛋白質(zhì)溶解度降低并析出，但此法易使蛋白質(zhì)變性，應(yīng)在低溫下進(jìn)行[7].本研究綜合各方面因素?cái)M用鹽析法提取纖維素酶.生產(chǎn)纖維素酶的菌種有很多，如細(xì)菌、真菌等，唯以真菌所產(chǎn)纖維素酶組份最齊全，且是胞外酶，故是工業(yè)生產(chǎn)的首選菌種[8].本課題選用的 HC－415菌株，屬真菌中的里氏木霉，可利用稻草分泌高活性的纖維素酶；同時(shí)，還可產(chǎn)生許多半纖維素酶、果膠酶、淀粉酶和蛋白酶等.

1 材料、儀器與試劑

菌種：里 氏 木 霉 （Trichodermareesei）HC－415，湖南大學(xué)生物學(xué)院提供.材料與試劑：稻草粉，豆粕，麩皮，羧甲基纖維素鈉，新華1號(hào)濾紙等.儀器設(shè)備：30L規(guī)模發(fā)酵罐，旋轉(zhuǎn)式搖床，高速冷凍離心機(jī)等.

2 培養(yǎng)基

斜面種培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基.一級(jí)種培養(yǎng)基（%，w／v）：麩皮2，葡萄糖3，（NH4）2SO40.15，pH 5.5～6.0.二級(jí)產(chǎn)酶培養(yǎng)基（%，w／v）：稻草粉5，豆粕粉1，KH2PO41.0，CaCl20.6，聚 醚0.6，pH 5.5～6.0.一級(jí)種接種量為15%（v／v）.

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 纖維素酶液體深層發(fā)酵法

將HC－415菌斜面種的孢子液接入一級(jí)種培養(yǎng)基，28～30℃旋轉(zhuǎn)式搖床上培養(yǎng)40h，再接入30L規(guī)模罐二級(jí)產(chǎn)酶培養(yǎng)基中進(jìn)行液體深層產(chǎn)酶發(fā)酵試驗(yàn).

3.2 酶活性測(cè)定方法

羧甲基纖維素（CMC）酶活性測(cè)定：DNS法.

濾紙?zhí)敲福‵PA）活性測(cè)定：參照 Mandels[9]、蔣傳葵[10]DNS法.1mL適當(dāng)稀釋的酶液中加入1 mL 0.05mol／L （pH4.6）緩沖液和1條1cm×6 cm新華1號(hào)濾紙.50℃酶解60min，加3mL DNS試劑.沸水浴10min，測(cè)還原糖，扣除空白后計(jì)算酶活性.

酶液酶活性單位規(guī)定為：1h水解生成1mg葡萄糖的酶量為1個(gè)活性單位（U）.酶粉酶活性使用國(guó)際單位（IU）：1min水解生成1μmol葡萄糖的酶量為1個(gè)國(guó)際單位（IU）.

3.3 纖維素酶的提取

酶粗提取液的制備：放罐收集的發(fā)酵液，離心除去稻草等固型物，上清液即為酶粗提取液，粗酶液應(yīng)立即進(jìn)行后續(xù)處理，否則，應(yīng)放入4℃冰箱保存.

硫酸銨鹽析：在酶粗提取液中緩慢加入20%飽和度硫酸銨[11]，靜置2h，4℃離心20min，除去雜蛋白，取上清液緩慢加入80%飽和度硫酸銨，溶解后6 500r／min 4℃離心20min，沉淀用pH 5.0醋酸鹽緩沖液溶解，得纖維素酶濃縮液，于4℃冰箱保存.

濃縮液透析：向透析袋中加入濃縮液，預(yù)留約1／3的空間.在50%甘油的pH4.6的0.1mol／L醋酸－醋酸鈉緩沖液中透析4h.

纖維素酶粉的制取：將纖維素酶濃縮液放入冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行冷凍干燥，冷阱溫度為－50℃，真空度14～16Pa，冷凍24h制得纖維素酶粉.

4 結(jié)果與討論

4.1 30L規(guī)模罐中HC－415菌產(chǎn)纖維素酶發(fā)酵過(guò)程動(dòng)態(tài)變化

30L規(guī)模發(fā)酵罐裝液量20L，攪拌速度為200～450r／min，通氣量0.25～0.6L／（min·L），發(fā)酵溫度30±1℃，罐壓0.01～0.03MPa，培養(yǎng)144h.消泡劑聚醚添加量為0.6%.發(fā)酵過(guò)程中，間隔2h測(cè)定并記錄pH、通氣量、溫度、攪拌速度、泡沫等的變化；每隔12h取樣檢測(cè)酶活性，結(jié)果表明，如圖1，24h前CMC酶和FPA酶活性很低，基本處于停滯期.之后酶活性快速增長(zhǎng)，CMC酶和FPA酶活性在120h達(dá)到高峰，120～132h酶活性處于高峰穩(wěn)定期，綜合各因素，最適發(fā)酵周期為132h.

4.2 纖維素酶提取時(shí)酶的活性及酶活性得率

30L規(guī)模罐發(fā)酵液纖維素酶提取及酶活性得率結(jié)果見(jiàn)表1.凍干酶粉CMC酶活性平均為355.0 IU／g，最高為388.3IU／g，F(xiàn)PA平均為44.3IU／g，最高為58.2IU／g.相對(duì)發(fā)酵液得率平均為16.00 g／L.酶粉對(duì)發(fā)酵液CMC酶活性平均得率為77.16%，最高為89.14%，F(xiàn)PA酶活性平均得率為58.10%，最高為82.95%.

圖1 30L規(guī)模罐中HC－415菌產(chǎn)纖維素酶液體發(fā)酵動(dòng)態(tài)曲線圖Fig.1 The graph of cellulase liquid fermentation by HC－415fungus in 30Lfermenter

表1 30L規(guī)模罐發(fā)酵液纖維素酶活性及酶活性得率Tab.1 Cellulase activity and yield from 30Lfermenter broth

4.3 透析對(duì)纖維素酶活性得率的影響

將第3批次的纖維素酶濃縮液進(jìn)行透析，如表2，透析后體積縮小了35.0%，CMC酶活性得率為96.0%，F(xiàn)PA酶活性得率為95.5%.表明通過(guò)透析起到了濃縮的作用，而酶活性損失很少.透析后的濃縮液制得的酶粉活性為：CMC酶634.9IU／g，F(xiàn)PA84.7IU／g，表明透析還起到了脫鹽純化作用.

4.4 HC－415菌所產(chǎn)纖維素酶的最適pH

配制pH為3.0～9.0的磷酸氫二鈉和檸檬酸緩沖液，將HC－415菌所產(chǎn)纖維素酶液稀釋到適當(dāng)倍數(shù)，測(cè)定各pH 值的FPA酶活性（圖2），表明HC－415菌所產(chǎn)纖維素酶的最適pH值在4.0～5.0之間.

表2 透析對(duì)纖維素酶活性的影響Tab.2 The effect of dialysis for cellulase activity

圖2 不同pH下的HC－415菌FPA酶活性變化趨勢(shì)Fig.2 FPA variation tendency in different pH buffer solution

4.5 HC－415菌所產(chǎn)纖維素酶的最適反應(yīng)溫度

將HC－415菌所產(chǎn)纖維素酶液稀釋到適當(dāng)倍數(shù)，在30～70℃的水浴鍋中測(cè)定該菌FPA活性（圖3），表明其最適反應(yīng)溫度在50～60℃之間.

圖3 不同反應(yīng)溫度下的HC－415菌FPA酶活性變化趨勢(shì)Fig.3 FPA variation tendency in different reaction temperature buffer solution

4.6 HC－415菌纖維素酶粉性質(zhì)比較

幾種纖維素酶粉有關(guān)特性及酶活性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3.溶解性方面，HC－415與 ONOZUKA R－10酶粉均易容于稀醋酸鹽緩沖液，溶液淡黃透明.上海酒精二廠的纖維素酶粉僅溶解一部分，呈棕色混濁狀.HC－415與 ONOZUKA R－10酶粉均呈砂色.HC－415菌纖維素酶粉比上海酶粉FPA酶活性高29.9 IU／g.所以，在溶解性、色澤及FPA活性等方面，HC－415菌所產(chǎn)纖維素酶粉已接近或達(dá)到國(guó)內(nèi)、國(guó)外商品酶酶粉指標(biāo).

表3 不同纖維素酶粉性質(zhì)及活性比較Tab.3 Qualities and activity for several different cellulase powders

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