胚胎干細(xì)胞——血友病替代療法的新型“種子”細(xì)胞

最近，中國的一組科研人員的研究成果顯示：共表達(dá)凝血因子VIII、IX （coagulation factor-VIII or coagulation factor- IX ，F(xiàn)-VIII or F-IX)的胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell，ESC）源性肝細(xì)胞或可為血友病替代療法提供新型種子細(xì)胞來源。目前研究人員已通過細(xì)胞學(xué)實驗及分子生物學(xué)實驗證明由胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化得來的功能性肝細(xì)胞具有在體外合成并分泌凝血因子VIII、IX的能力。

血友病（Hemophilia）是目前臨床上最常見的先天性凝血障礙性疾病。其最主要的發(fā)病機(jī)制是由于凝血因子VIII或/和IX基因的突變或缺失，凝血因子VIII、IX缺陷分別導(dǎo)致血友病A和B的發(fā)生，其臨床癥狀的嚴(yán)重程度與血液循環(huán)中凝血因子VIII、IX蛋白的水平密切相關(guān)。替代治療被認(rèn)為是目前的標(biāo)準(zhǔn)治療方法，但是重組或血漿來源的凝血因子VIII、IX極易在血液循環(huán)中降解，并且其費(fèi)用也非常昂貴。轉(zhuǎn)基因技術(shù)雖然可以從根本上糾正凝血因子表達(dá)缺陷，但是基因表達(dá)效率低、維持時間短并引起免疫反應(yīng)。肝臟是產(chǎn)生凝血因子II 、V、 VII、VIII、IX 和X的器官，所以，凝血因子VIII和IX缺陷是肝細(xì)胞替代治療的適應(yīng)證。但供體肝細(xì)胞匱乏、培養(yǎng)肝細(xì)胞增殖能力差，以及經(jīng)過凍存的肝細(xì)胞活力低等關(guān)鍵問題一直難以得到有效地解決，限制了肝細(xì)胞的應(yīng)用。

胚胎干細(xì)胞是從哺乳動物的囊胚內(nèi)細(xì)胞群經(jīng)體外培養(yǎng)并分離克隆出來的一種原始、高度未分化細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞具有自我復(fù)制、更新和發(fā)育全能性并能產(chǎn)生后代的能力，在特定條件下可分化為人體200 多種細(xì)胞類型，所以可用于構(gòu)建心、肝、腎等各種組織和器官的研究。越來越多的研究表明，胚胎干細(xì)胞由于其無限增殖能力和多向分化潛能，有望為細(xì)胞移植治療各種難治性疾病提供新的細(xì)胞來源。目前誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為肝細(xì)胞的研究已取得一定進(jìn)展，但國際上關(guān)于胚胎干細(xì)胞源性肝細(xì)胞是否表達(dá)凝血因子的報道仍非常有限。如果可以成功建立一種共表達(dá)凝血因子VIII、IX的胚胎干細(xì)胞源性肝細(xì)胞的培養(yǎng)體系，將有望為血友病A和B的細(xì)胞替代治療提供充足的、新型“種子”細(xì)胞來源。

凝血因子VIII、IX由成熟肝臟細(xì)胞合成并分泌，而高效誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為功能性成熟肝細(xì)胞仍是目前干細(xì)胞研究領(lǐng)域的一大難點(diǎn)。研究人員建立了一種高效誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化的培養(yǎng)體系，通過表觀遺傳學(xué)修飾及多種誘導(dǎo)因子聯(lián)合貫續(xù)應(yīng)用，獲得了更加接近于成熟肝細(xì)胞的胚胎干細(xì)胞源性肝細(xì)胞，并進(jìn)一步證實所獲得的胚胎干細(xì)胞源性肝細(xì)胞具有在體外合成并分泌凝血因子VIII、IX的能力。

這篇研究發(fā)表在最新一期《中國藥理學(xué)報》[Acta Pharmacologica Sinica 2010: 1-9]上，由中山大學(xué)附屬孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院肝膽胰外科閔軍教授、陳亞進(jìn)教授以及曹君博士領(lǐng)導(dǎo)的研究小組完成，并獲得國家863基金及國家自然基金資助。研究小組將組蛋白去乙酰化酶抑制劑丁酸鈉、骨形態(tài)發(fā)生蛋白4（BMP-4）及堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)聯(lián)合作用，促使小鼠胚胎干細(xì)胞分化為內(nèi)胚層細(xì)胞和肝臟前體細(xì)胞，分化后期在肝細(xì)胞生長因子(HGF)、抑瘤素M(OSM)和地塞米松(DEX)作用下，肝臟前體細(xì)胞可以進(jìn)一步分化為成熟肝臟細(xì)胞。研究人員同時通過RT-PCR、real-time PCR、western blot、和流式細(xì)胞技術(shù)檢測到凝血因子Ⅷ、Ⅸ在基因及蛋白水平的共表達(dá)。流式細(xì)胞技術(shù)分析結(jié)果顯示凝血因子Ⅷ、Ⅸ雙陽性的肝細(xì)胞比例達(dá)到70%以上，在作為對照的自發(fā)分化細(xì)胞中則無上述因子的表達(dá)。而經(jīng)ELISA技術(shù)對細(xì)胞培養(yǎng)上清的檢測，更是證實了此種由胚胎干細(xì)胞源性肝細(xì)胞所合成的凝血因子Ⅷ、Ⅸ能夠成功地被分泌至細(xì)胞外。由此，該研究小組建立了一個新穎的誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞分化為穩(wěn)定共表達(dá)凝血因子Ⅷ、Ⅸ的成熟肝細(xì)胞分化體系，并明確組蛋白去乙酰化酶抑制劑丁酸鈉與細(xì)胞因子BMP-4和bFGF對小鼠胚胎干細(xì)胞的肝系分化具有協(xié)同促進(jìn)作用。在課題組開展的上述研究中，之所以能夠獲得高純度的共表達(dá)凝血因子Ⅷ、Ⅸ的小鼠胚胎干細(xì)胞源性肝細(xì)胞，重要原因之一為誘導(dǎo)分化因子丁酸鈉的作用。丁酸鈉是一種組蛋白去乙酰化酶抑制劑，可以通過組蛋白修飾的方式使組蛋白超乙酰化，并激活一些轉(zhuǎn)錄因子，使其結(jié)合并激活某些基因，從而誘導(dǎo)細(xì)胞分化。

閔軍教授和陳亞進(jìn)教授的研究小組表示，該研究證實了共表達(dá)凝血因子VIII、IX的胚胎干細(xì)胞源性肝細(xì)胞在血友病替代療法中的潛在價值，所獲得的更加接近于成熟肝細(xì)胞的功能性分化細(xì)胞將為細(xì)胞體內(nèi)移植實驗提供充足、安全的細(xì)胞來源，進(jìn)一步為干細(xì)胞移植治療血友病的更深入研究奠定堅實的實驗基礎(chǔ)。