SDS－PAGE有毒物質(zhì)的危害及預(yù)防措施

汪浩

（杭州師范大學(xué) 醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，浙江 杭州 310036）

1 引言

聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)是生物科學(xué)研究的基礎(chǔ)技術(shù)之一，是分離純化核酸和蛋白質(zhì)、檢測(cè)蛋白質(zhì)純度、評(píng)估蛋白質(zhì)分子量的基本方法。實(shí)驗(yàn)時(shí)間較長(zhǎng)，操作步驟復(fù)雜，其中不少試劑是有毒物質(zhì)，危害較大，部分還會(huì)導(dǎo)致慢性中毒。

2 常用有毒試劑

（1）丙烯酰胺為一種白色晶體化學(xué)物質(zhì)，是生產(chǎn)聚丙烯酰胺的原料，屬中等毒性物質(zhì)。可通過(guò)皮膚吸收及呼吸道進(jìn)入人體，因此，在搬運(yùn)和使用中必須穿戴好防護(hù)用具，如防毒服、防毒口罩及防毒手套等。丙烯酰胺的危害主要是引起神經(jīng)毒性，同時(shí)還有生殖、發(fā)育毒性 。神經(jīng)毒性作用表現(xiàn)為周?chē)窠?jīng)退行性變化和腦中涉及學(xué)習(xí)、記憶和其他認(rèn)知功能部位的退行性變化，試驗(yàn)還顯示丙烯酰胺是一種可能致癌物，職業(yè)接觸人群的流行病學(xué)觀察表明:長(zhǎng)期低劑量接觸丙烯酰胺會(huì)出現(xiàn)嗜睡、情緒和記憶改變、幻覺(jué)和震顫等癥狀，伴隨末梢神經(jīng)病如手套樣感覺(jué)、出汗和肌肉無(wú)力。累積毒性，不容易排毒。具備以下任何一項(xiàng)者，可列為慢性丙烯酰胺中毒觀察對(duì)象:接觸丙烯酰胺的局部皮膚出現(xiàn)多汗、濕冷、脫皮、紅斑；出現(xiàn)肢端麻木、刺痛、下肢乏力、嗜睡等癥狀；神經(jīng)－肌電圖顯示有可疑神經(jīng)源性損害。

丙烯酰胺具有致突變作用，可引起哺乳動(dòng)物體細(xì)胞和生殖細(xì)胞的基因突變和染色體異常。動(dòng)物試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，丙烯酰胺可致大鼠多種器官腫瘤，如乳腺、甲狀腺、睪丸、腎上腺、中樞神經(jīng)、口腔、子宮、腦下垂體腫瘤等。但目前還沒(méi)有充足的人群流行病學(xué)證據(jù)表明，食物攝入丙烯酰胺與人類某種腫瘤的發(fā)生有明顯相關(guān)性。國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）對(duì)其致癌性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，將丙烯酰胺列為2類致癌物（2A），即人類可能致癌物。其主要依據(jù)為丙烯酰胺在動(dòng)物和人體均可代謝轉(zhuǎn)化為致癌活性代謝產(chǎn)物環(huán)氧丙酰胺。

（2）N，N－亞甲基雙丙烯酰胺具有毒性，影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)，切勿吸入粉末。

（3）十二烷基硫酸鈉（SDS）具有毒性，是一種刺激物，并造成對(duì)眼睛的嚴(yán)重?fù)p傷的危險(xiǎn)。可因吸入、咽下或皮膚吸收而損害健康。應(yīng)戴合適的手套和安全護(hù)目鏡，不要吸入其粉末。

（4）AP過(guò)硫酸銨［（NH4）2S2O8］對(duì)黏膜和上呼吸道組織、眼睛和皮膚有極大危害性。吸入可致命。操作時(shí)應(yīng)戴合適的手套、安全眼鏡和防護(hù)服。始終在通風(fēng)櫥里操作，操作完后徹底洗手。

（5）TEMED N，N，N＇，N＇－四甲基乙二胺具有強(qiáng)神經(jīng)毒性，防止誤吸，操作時(shí)快速，存放時(shí)密封。

（6）甲醇為一種無(wú)色、透明、易燃、易揮發(fā)的有毒液體，經(jīng)人體代謝產(chǎn)生甲醛和甲酸（俗稱蟻酸）.甲酸會(huì)累積在眼睛部位，破壞視覺(jué)神經(jīng)細(xì)胞，產(chǎn)生永久性損害.甲酸進(jìn)入血液后，會(huì)使組織酸性越來(lái)越強(qiáng)，損害人體腎臟，導(dǎo)致腎衰竭［1］甲醇略帶有酒精氣味，具有較強(qiáng)毒性，對(duì)人體的神經(jīng)系統(tǒng)和血液系統(tǒng)影響最大，經(jīng)消化道、呼吸道或皮膚攝入都會(huì)產(chǎn)生毒性反應(yīng)，甲醇蒸氣損害人的呼吸道粘膜和視力，注意要在通風(fēng)櫥里操作。

（7）乙酸又稱醋酸。冰醋酸常溫下具有強(qiáng)烈刺激性酸味，吸入后對(duì)鼻、喉和呼吸道有刺激性。對(duì)眼睛有強(qiáng)烈刺激作用。皮膚接觸，輕者出現(xiàn)紅斑，重者引起化學(xué)灼傷。冰醋酸對(duì)身體還有慢性影響，如眼瞼水腫、結(jié)膜充血、慢性咽炎和支氣管炎。長(zhǎng)期反復(fù)接觸，可致皮膚干燥、脫脂和皮炎等［2］。

3 預(yù)防措施

3.1 配膠

制板前要將玻璃洗凈曬干備用，如果急用可用電吹風(fēng)吹干或用濾紙吸干。按BIO－RAD電泳槽說(shuō)明書(shū)組裝凝膠模具。膠盡可能配1.5mm厚，既不易捏破又可以用微波爐加熱。考慮到健康安全因素和實(shí)際效果，我們對(duì)配制順序作了改進(jìn)。先加其它試劑，然后加入30%Acr－Bis（29∶1）溶液，加速催化劑TEMED最后加入。由于不少實(shí)驗(yàn)室沒(méi)有通風(fēng)櫥，用2只50mL塑料離心管代替小燒杯作為配膠容器，離心管用記號(hào)筆寫(xiě)上分離膠、濃縮膠，專管專用。用槍吸取TEMED加入分離膠液體里，搖勻待用。

3.1.1 分離膠的灌制

分離膠混勻后馬上用槍吸取分離膠溶液，沿玻璃板緩慢加入模具內(nèi)，小心避免產(chǎn)生氣泡，灌膠至短玻璃約1.5cm處，把槍頭打入分離膠離心管內(nèi)。然后輕輕在分離膠溶液上覆蓋一層異丙醇隔絕空氣，可使凝膠表面變得平整。由于異丙醇比較輕，不會(huì)導(dǎo)致分離膠下沉。而常規(guī)的超純水層或0.1%SDS溶液比較重，加入就導(dǎo)致分離膠液面下沉，從而引起膠面不平整。看到膠表面與上層異丙醇之間有一條明顯的界面，表明膠已經(jīng)凝固。聚合時(shí)間主要由TEMED和溫度決定，天冷的季節(jié)可把凝膠模具放入二氧化碳培養(yǎng)箱以縮短時(shí)間。用濾紙吸干水分，濾紙不能接觸膠面，防止膠面不平，即可加上濃縮膠。

3.1.2 濃縮膠的灌制

用槍吸取濃縮膠溶液緩慢加入，直至凝膠溶液到達(dá)前玻璃板的頂端，把槍頭打入濃縮膠離心管內(nèi)。有時(shí)模具輕微滲漏，導(dǎo)致濃縮膠溶液不夠，須用樣品梳子傾斜趕走氣泡后慢慢插入。樣品梳子要用力均勻，防止濺出。有些樣品梳子與凝膠模具不是非常精密，難以插入，很容易導(dǎo)致濃縮膠溶液濺到眼睛，這點(diǎn)特別要注意。如何判斷膠是否已經(jīng)凝固，可以觀察濃縮膠離心管內(nèi)液體。一般情況下，玻璃板內(nèi)的濃縮膠要先于離心管凝固。天氣炎熱時(shí)，該膠成膠很快，加入濃縮膠溶液后要馬上插好樣品梳，否則濃縮膠已經(jīng)凝固而無(wú)法插入樣品梳，做不好加樣孔導(dǎo)致配膠失敗。這種情況可考慮減少配方中TEMED用量，降低凝固速度。凝膠時(shí)間長(zhǎng)會(huì)出現(xiàn)皺縮，不馬上用的話，用浸濕的吸水紙包住玻璃板放入冰箱冷藏。

3.2 電泳

將凝膠放入電泳槽內(nèi)，把電泳緩沖液加入內(nèi)外電泳槽中，使凝膠的上下端均能浸泡在緩沖液中，兩手用力均勻一致地拔出樣品梳。需同時(shí)放置兩塊制好的膠，如只使用一塊則另一面須用電泳儀生產(chǎn)廠家提供的塑料板代替，注意塑料板上的提示，必須使塑料板與橡膠條完全緊貼［3，4］。加樣時(shí)，槍頭伸入加樣孔底部，左手抵住槍管，慢慢加樣，不能讓樣品溢出加樣孔，否則會(huì)影響后面的定量分析。選用10μL槍頭，而更大體積的槍頭伸不到加樣孔里面，很容易導(dǎo)致樣品外溢。打開(kāi)電源，注意正負(fù)極，電泳開(kāi)始，可看見(jiàn)鉑金絲附近有氣泡生成。

3.3 染色

常規(guī)的SDS－PAGE染色脫色耗時(shí)長(zhǎng)，還需使用甲醇，用無(wú)毒的乙醇替代有毒的甲醇。改進(jìn)后的SDS－PAGE染色脫色具有耗時(shí)短，且不需要使用甲醇的優(yōu)點(diǎn)［5］。

［1］謝克昌.甲醇及其衍生物［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2002.

［2］白 璐，廖林川，顏有儀，等.揮發(fā)性有機(jī)溶劑的危害及濫用［J］.法律與醫(yī)學(xué)雜志，2005，12（2）:135～136.

［3］Merril C R.Gel－staining techniques［J］.Methods Enzy－mol，1990（182）:477～488.

［4］汪家政.范 明.蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè)［M］.北京:科學(xué)出版社，2000.

［5］葉長(zhǎng)春.SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳染色方法的改進(jìn)［J］.湖北工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009（4）:16～18.