SDS－PAGE有毒物質的危害及預防措施

汪浩

（杭州師范大學 醫學實驗中心，浙江 杭州 310036）

1 引言

聚丙烯酰胺凝膠電泳技術是生物科學研究的基礎技術之一，是分離純化核酸和蛋白質、檢測蛋白質純度、評估蛋白質分子量的基本方法。實驗時間較長，操作步驟復雜，其中不少試劑是有毒物質，危害較大，部分還會導致慢性中毒。

2 常用有毒試劑

（1）丙烯酰胺為一種白色晶體化學物質，是生產聚丙烯酰胺的原料，屬中等毒性物質。可通過皮膚吸收及呼吸道進入人體，因此，在搬運和使用中必須穿戴好防護用具，如防毒服、防毒口罩及防毒手套等。丙烯酰胺的危害主要是引起神經毒性，同時還有生殖、發育毒性 。神經毒性作用表現為周圍神經退行性變化和腦中涉及學習、記憶和其他認知功能部位的退行性變化，試驗還顯示丙烯酰胺是一種可能致癌物，職業接觸人群的流行病學觀察表明:長期低劑量接觸丙烯酰胺會出現嗜睡、情緒和記憶改變、幻覺和震顫等癥狀，伴隨末梢神經病如手套樣感覺、出汗和肌肉無力。累積毒性，不容易排毒。具備以下任何一項者，可列為慢性丙烯酰胺中毒觀察對象:接觸丙烯酰胺的局部皮膚出現多汗、濕冷、脫皮、紅斑；出現肢端麻木、刺痛、下肢乏力、嗜睡等癥狀；神經－肌電圖顯示有可疑神經源性損害。

丙烯酰胺具有致突變作用，可引起哺乳動物體細胞和生殖細胞的基因突變和染色體異常。動物試驗研究發現，丙烯酰胺可致大鼠多種器官腫瘤，如乳腺、甲狀腺、睪丸、腎上腺、中樞神經、口腔、子宮、腦下垂體腫瘤等。但目前還沒有充足的人群流行病學證據表明，食物攝入丙烯酰胺與人類某種腫瘤的發生有明顯相關性。國際癌癥研究機構（IARC）對其致癌性進行了評價，將丙烯酰胺列為2類致癌物（2A），即人類可能致癌物。其主要依據為丙烯酰胺在動物和人體均可代謝轉化為致癌活性代謝產物環氧丙酰胺。

（2）N，N－亞甲基雙丙烯酰胺具有毒性，影響中樞神經系統，切勿吸入粉末。

（3）十二烷基硫酸鈉（SDS）具有毒性，是一種刺激物，并造成對眼睛的嚴重損傷的危險?？梢蛭?、咽下或皮膚吸收而損害健康。應戴合適的手套和安全護目鏡，不要吸入其粉末。

（4）AP過硫酸銨［（NH4）2S2O8］對黏膜和上呼吸道組織、眼睛和皮膚有極大危害性。吸入可致命。操作時應戴合適的手套、安全眼鏡和防護服。始終在通風櫥里操作，操作完后徹底洗手。

（5）TEMED N，N，N＇，N＇－四甲基乙二胺具有強神經毒性，防止誤吸，操作時快速，存放時密封。

（6）甲醇為一種無色、透明、易燃、易揮發的有毒液體，經人體代謝產生甲醛和甲酸（俗稱蟻酸）.甲酸會累積在眼睛部位，破壞視覺神經細胞，產生永久性損害.甲酸進入血液后，會使組織酸性越來越強，損害人體腎臟，導致腎衰竭［1］甲醇略帶有酒精氣味，具有較強毒性，對人體的神經系統和血液系統影響最大，經消化道、呼吸道或皮膚攝入都會產生毒性反應，甲醇蒸氣損害人的呼吸道粘膜和視力，注意要在通風櫥里操作。

（7）乙酸又稱醋酸。冰醋酸常溫下具有強烈刺激性酸味，吸入后對鼻、喉和呼吸道有刺激性。對眼睛有強烈刺激作用。皮膚接觸，輕者出現紅斑，重者引起化學灼傷。冰醋酸對身體還有慢性影響，如眼瞼水腫、結膜充血、慢性咽炎和支氣管炎。長期反復接觸，可致皮膚干燥、脫脂和皮炎等［2］。

3 預防措施

3.1 配膠

制板前要將玻璃洗凈曬干備用，如果急用可用電吹風吹干或用濾紙吸干。按BIO－RAD電泳槽說明書組裝凝膠模具。膠盡可能配1.5mm厚，既不易捏破又可以用微波爐加熱?？紤]到健康安全因素和實際效果，我們對配制順序作了改進。先加其它試劑，然后加入30%Acr－Bis（29∶1）溶液，加速催化劑TEMED最后加入。由于不少實驗室沒有通風櫥，用2只50mL塑料離心管代替小燒杯作為配膠容器，離心管用記號筆寫上分離膠、濃縮膠，專管專用。用槍吸取TEMED加入分離膠液體里，搖勻待用。

3.1.1 分離膠的灌制

分離膠混勻后馬上用槍吸取分離膠溶液，沿玻璃板緩慢加入模具內，小心避免產生氣泡，灌膠至短玻璃約1.5cm處，把槍頭打入分離膠離心管內。然后輕輕在分離膠溶液上覆蓋一層異丙醇隔絕空氣，可使凝膠表面變得平整。由于異丙醇比較輕，不會導致分離膠下沉。而常規的超純水層或0.1%SDS溶液比較重，加入就導致分離膠液面下沉，從而引起膠面不平整。看到膠表面與上層異丙醇之間有一條明顯的界面，表明膠已經凝固。聚合時間主要由TEMED和溫度決定，天冷的季節可把凝膠模具放入二氧化碳培養箱以縮短時間。用濾紙吸干水分，濾紙不能接觸膠面，防止膠面不平，即可加上濃縮膠。

3.1.2 濃縮膠的灌制

用槍吸取濃縮膠溶液緩慢加入，直至凝膠溶液到達前玻璃板的頂端，把槍頭打入濃縮膠離心管內。有時模具輕微滲漏，導致濃縮膠溶液不夠，須用樣品梳子傾斜趕走氣泡后慢慢插入。樣品梳子要用力均勻，防止濺出。有些樣品梳子與凝膠模具不是非常精密，難以插入，很容易導致濃縮膠溶液濺到眼睛，這點特別要注意。如何判斷膠是否已經凝固，可以觀察濃縮膠離心管內液體。一般情況下，玻璃板內的濃縮膠要先于離心管凝固。天氣炎熱時，該膠成膠很快，加入濃縮膠溶液后要馬上插好樣品梳，否則濃縮膠已經凝固而無法插入樣品梳，做不好加樣孔導致配膠失敗。這種情況可考慮減少配方中TEMED用量，降低凝固速度。凝膠時間長會出現皺縮，不馬上用的話，用浸濕的吸水紙包住玻璃板放入冰箱冷藏。

3.2 電泳

將凝膠放入電泳槽內，把電泳緩沖液加入內外電泳槽中，使凝膠的上下端均能浸泡在緩沖液中，兩手用力均勻一致地拔出樣品梳。需同時放置兩塊制好的膠，如只使用一塊則另一面須用電泳儀生產廠家提供的塑料板代替，注意塑料板上的提示，必須使塑料板與橡膠條完全緊貼［3，4］。加樣時，槍頭伸入加樣孔底部，左手抵住槍管，慢慢加樣，不能讓樣品溢出加樣孔，否則會影響后面的定量分析。選用10μL槍頭，而更大體積的槍頭伸不到加樣孔里面，很容易導致樣品外溢。打開電源，注意正負極，電泳開始，可看見鉑金絲附近有氣泡生成。

3.3 染色

常規的SDS－PAGE染色脫色耗時長，還需使用甲醇，用無毒的乙醇替代有毒的甲醇。改進后的SDS－PAGE染色脫色具有耗時短，且不需要使用甲醇的優點［5］。

［1］謝克昌.甲醇及其衍生物［M］.北京:化學工業出版社，2002.

［2］白 璐，廖林川，顏有儀，等.揮發性有機溶劑的危害及濫用［J］.法律與醫學雜志，2005，12（2）:135～136.

［3］Merril C R.Gel－staining techniques［J］.Methods Enzy－mol，1990（182）:477～488.

［4］汪家政.范 明.蛋白質技術手冊［M］.北京:科學出版社，2000.

［5］葉長春.SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳染色方法的改進［J］.湖北工業大學學報，2009（4）:16～18.