影響免疫組織化學染色質量的因素分析

顧冬梅，劉 蔚

（1.蘇州大學附屬第一醫院病理科；2.蘇州大學醫學部，江蘇蘇州 215123）

影響免疫組織化學染色質量的因素分析

顧冬梅1,2，劉 蔚1

（1.蘇州大學附屬第一醫院病理科；2.蘇州大學醫學部，江蘇蘇州 215123）

免疫組化技術操作過程中存在很多影響因素，直接影響到免疫組化染色質量。要獲得滿意的免疫組化染色結果，必須采取可行有效的辦法，從而為病理診斷提供可靠依據。

免疫組織化學；染色質量；影響因素

免疫組織化學是利用抗原抗體特異性結合這一原理，從組織細胞水平進行抗原抗體反應，對某些蛋白在組織切片或細胞標本中進行原位的定位、定性或定量研究的一種技術[1]。免疫組織化學技術是現代生物學領域中一項不可或缺的研究手段，尤其在臨床病理診斷中發揮著極其重要的作用，為病理診斷提供有價值的線索。近年來，隨著免疫組化技術的發展和各種特異性抗體的出現，許多疑難腫瘤得到了明確診斷，從而進一步提高了病理診斷的準確性，為疾病的治療和預后的估計提供了重要的依據。分子醫學的發展，將治療性的人源性單克隆抗體引入了臨床，免疫組織化學技術已經作為一項獨立的檢測指標用于指導臨床的個性化治療[2]。良好的免疫組化染色切片是正確判斷染色結果的基礎和前提。但是，由于免疫組化技術操作的影響因素眾多，常常導致免疫組化染色質量不穩定，影響最終診斷。如何避免和消除這些因素的影響，是我們每一位病理學工作者都希望解決的問題。對此，我們總結以往操作經驗，歸納分析影響免疫組化染色質量的各種因素，旨在提高染色質量，獲得滿意的免疫組化染色結果。

企業最重要的發展戰略就是對企業內部各個環節的管理控制，在服裝制造的各個過程中要加強監管力度，保障各個階段的生產制造過程都盡量零失誤，使得企業在產品的質量上有保障。此外，企業要積極的響應“一帶一路”的發展戰略，利用國家的優勢發展，促進企業的品牌提升。

1 組織處理的影響因素

1.1 組織的取材、脫水及浸蠟 恰當的組織處理是做好免疫組化染色的先決條件，也是決定染色成敗的內部因素，不僅要求有效防止組織成分的自溶，保持組織結構和細胞形態的完整性，更需要保持細胞組織成分的抗原不受彌散或損壞。組織的處理包括組織的及時取材、固定和適宜的石蠟包埋處理。

——寧夏的一名高考落榜生被哈佛大學錄取，并給予全額獎學金。這位姓楊的學生花了很多精力建立一個非政府公益組織，支援西部教育。哈佛方面對此作出如是解釋。

取材是組織處理的第一步，免疫組化的取材特別強調及時，同時要注意：工具要銳利，切忌反復切拉組織造成局部組織的擠壓、壞死；組織塊大小要適中，理想的取材大小為0.2cm× 1cm×1cm，這樣既能使固定劑快速有效地滲透到組織內部，使其充分地固定，也有利于脫水和浸蠟，又能防止組織的脫片。組織在脫水機中的處理條件應十分妥當，大量的實踐經驗表明，在加熱抗原修復過程中組織脫片的主要原因是取材過厚和脫水浸蠟處理不當所致。免疫組化要求組織脫水透明要夠而不過，浸蠟的溫度不宜超過58℃，時間過長會造成組織收縮和透明過度，其結果是組織切片困難，染色過程也極易脫片，且染色效果不好，如果HE切片尚做不出滿意的染色結果，那么根本無法保證免疫組化的染色質量。

近年來，泥石流災害研究已經成為了全球關注的熱點問題，由于世界各國的自然地理條件和經濟發展情況的差異，呈現出不同的研究方法與技術手段，并且在研究對象的選擇上也大不相同，但是隨著互聯網的普及，各地區泥石流領域的研究與交流日益加深，泥石流研究的基本方法和觀念等趨于統一。就我國而言，針對泥石流的相關研究起步相對較晚，以致于對泥石流的理論研究和實際觀測趨于同步展開。

2.1 抗原修復及染色操作 在免疫組化染色中，抗原修復是影響染色結果極其重要的因素。所謂抗原修復，即破壞組織固定時分子間所形成的交聯，而恢復抗原的原有空間形態。大量實踐證明，加熱抗原修復處理后的免疫組化染色敏感度大幅度地提高，因此得到了廣泛的使用，為大多數抗體染色修復時所選用。而熱修復中強力推薦使用高溫高壓抗原修復方法，實驗結果顯示，高壓法的實驗重現性與染色強度均優于其他熱修復法（水浴法及微波法）。加熱抗原修復緩沖液有多種，目前首選為0.01%檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0），優點是染色背景清晰，適合于大多數抗體[4]。但部分難于表達的抗體應選擇EDTA和Tris抗原修復效果較強的緩沖修復液為宜。

1.2 組織的固定 組織固定要及時充分。在眾多的組織固定液中，如甲醛、乙醇、戊二醛、B5等等這些不同種類固定液在不同實驗方法（如PCR、電鏡、免疫組化、分子雜交等）的使用中各有千秋。但在保持組織和細胞結構的完整性、抗原可測定性、組織滲透性以及試劑的價格上，福爾馬林都是首選。而在免疫組化染色中，固定劑首推的是10%中性福爾馬林，福爾馬林固定引起的組織抗原決定簇的交聯與封閉可以通過抗原修復方法來修正[3]。為確保離體組織的抗原性，必須在手術后的15min內馬上固定，組織須浸沒于固定液中，對于絕大部分組織，在常溫條件下固定8-24h最佳。

通常免疫組化染色采用的是辣根過氧化物酶系統，其檢測方法簡便易行，試劑穩定。因此顯色劑首選的是DAB，其配制方法簡單，在組織切片上定位比較清晰，染色結果非常容易保存。DAB顯色時間以及DAB顯色劑的濃度對免疫組化的染色結果有很大影響，濃度過高、時間過長均會造成染色結果太深而影響觀測甚至造成假陽性，因此DAB應遵循說明書濃度現配現用，時間控制以在鏡下為佳，顯色以在2-10min內為宜。最后用蘇木素復染后應讓流水徹底沖洗切片，再浸入溫水使其充分藍化，這樣DAB染色與背景襯染對照效果較好，有利于免疫組化染色結果的觀測。

2 染色過程和結果判讀的影響因素

1.3 組織的防脫片、切片、烘片及脫蠟 玻片的處理是做好免疫組化染色的重要步驟，尤其需要微波或高壓等抗原修復的標本極易造成脫片，其玻片的處理就格外重要，應選用多聚左旋賴氨酸或APES等粘附劑對載玻片進行處理。在日常工作中，我們選用APES對載玻片進行處理，將玻片放入1：50比例丙酮稀釋的APES中，停留20-30秒，取出稍停，再入純丙酮涮去未結合的APES，晾干后使用，可取得極好的防脫片效果。另外，免疫組化切片要求平整、無皺褶、無刀痕，因為皺褶、刀痕處可出現假陽性，切片厚度一般要求為3-4um，要盡可能地薄。實踐證明，越是薄而平的切片，越不易脫片。切片在56℃-60℃恒溫箱里應充分烘烤，至少烘片1小時才不至于脫片，但溫度過高或時間過長抗原容易丟失，故實際工作中，我們把組織切片置于58℃-60℃的恒溫箱中烘烤1-2小時或37℃恒溫箱中過夜，可使切片牢固而防脫片。

在免疫組化染色中若采用過氧化物酶的檢測系統，必須進行內源性過氧化物酶封閉處理。如果不進行處理，組織中的紅細胞、粒細胞會干擾染色結果的判斷。一般采用較緩和的方法：0.3% H2O2進行封閉處理，對染色結果沒有影響。染色過程中采用的沖洗緩沖液為PBS（pH7.2-pH7.4），加入適量的Tween20可增強沖洗效果。若沖洗不充分，會出現非特異性背景染色，故實際操作中應嚴格遵守實驗沖洗步驟。

第一抗體是免疫組化中最重要的試劑。目前市售的抗體有兩種：濃縮型抗體和即用型抗體。濃縮型抗體可小量分裝凍存（但應避免反復凍融而影響效價），應用前要在本實驗室進行成倍數項實驗找出最佳稀釋度，也就是最佳的抗體染色和最低的背景著色，還應遵循現用現配的原則，對于PBS稀釋的抗體一定要當天使用，最好應用專門的抗體稀釋液來稀釋抗體。即用型抗體可直接使用，一般4℃保存有效期為24個月，操作方便，比較適合日常工作使用。合適的孵育時間也是保證良好染色結果的重要因素。大部分一抗的孵育時間為37℃條件下1h，或4℃冰箱過夜最為合適。

免疫組化染色的脫蠟步驟與常規HE脫蠟步驟相同，但免疫組化脫蠟需完全干凈，最佳方法是與常規脫蠟分開以保證脫蠟徹底，否則可能導致染色結果的異常。

圖5顯示的是不同電源電壓下基準電壓隨溫度的變化。由仿真結果可知，1.2 V電源電壓下，在-40～110℃的溫度范圍內，基準電壓的溫漂系數為24 ppm/℃；常溫下，在0.9～2 V電源電壓范圍內，基準電壓的電源電壓調整率為0.48%/V。

2.2 實驗對照及結果判斷 要準確判斷免疫組化染色是否成功，必須在染色過程中設立陰性及陽性對照。陰性對照：選擇組織中無待測抗原，加載一抗后，觀察與一抗有無交叉反應。陽性對照：選擇組織中含有待測抗原，加載一抗后，觀測與一抗結合的特異性。在實驗染色中，陰性和陽性對照切片的實驗抗原修復條件必須與待測一抗切片的實驗條件完全一致，陰性和陽性對照均取得預期染色結果，本次免疫組化染色結果才是可靠的。

實驗染色結果觀察判斷中，真陽性與假陽性的判定需要豐富的經驗，真陽性染色結果應表達在預期對應的組織結構中，定位清晰準確；假陽性一般出現在非預期對應的組織中。個別抗體偶爾出現定位異常，如CD20（L26）偶爾見核表達[5]，部分淋巴瘤中可以出現上皮膜抗原（EMA）的表達，均是可以的。

3 結語

綜上所述，影響免疫組化染色質量的因素及環節眾多。正確認識及分析這些因素，才能盡可能消除和避免這些因素對免疫組化染色質量的影響，如采用10%中性福爾馬林固定液固定組織，使用高溫高壓抗原修復方法及適當的抗原修復液，選擇合格的免疫組化試劑及恰當的染色方法，設立正確的實驗對照，并嚴格按照操作規范進行實驗操作，才能獲得令人滿意的免疫組化染色結果，使免疫組化技術真正成為精確可靠的臨床病理輔助診斷手段。

[1]許良中.實用腫瘤病理方法學[M].上海:上海醫科大學出版社,1997.

[2]Tarlor C R.The total test approach to standardization of im munohistochemistry[J].Arch Pathol Lab Med,2000,124:945 -951.

[3]Battifora H,KopinskiM.The influence of protease digestion and duration of fixation on the immuno-staining ofkeratins:a comparison of formalin and ethanol fixation[J].The Jou-rnal ofHistochemistry and Cytochemistry,1986,34:1095-1100.

[4]Elias J,Margiotta M.Low temperature antigen restoration of steroid hormone receptor roteins in routine paraffin sections [J].Histotechnol,1997,20(2):155-158.

[5]紀小龍,施作霖.診斷免疫組織化學[M].北京:軍事醫學科學出版社,1997.

Factor’s Analysison Influencing the Staining Qualitiesof Immunohistochem istry

GU Dong-mei，LIUWei
(DepartmentofPathology，TheFirstAffiliatedHospitalofSoochowUniversity，SuzhouJiangsu215006，China)

There are various influencing factors in operating technicalskillof immunohistochem istry，which directly affectstaining qualitiesof immunohistochem istry.Practicable and effectivemethodsmustbe taken to obtain the satisfied results of immunohistochem istry and thus provide reliable evidence for the pathologicaldiagnosis.

immunohistochem istry；staining quality；influencing factor

R446

A

1671-0142（2011）06-0066-03

顧冬梅（1977-）,女,江蘇蘇州人,主管技師,在讀碩士研究生,研究方向為病理與病理生理學.

（責任編輯 劉 紅）